1. 提示：第一次使用前请先在漂洗液 RW 瓶中加入指定量无水乙醇!
2. 取 0.25 ml 血液（或血清，血浆，脑脊液等等)加入 0.75 ml 柱式血液 RNAout溶液 A，用加样枪吹打液体样品几次以帮助裂解样品中细胞。柱式血液RNAout 溶液 A 和液体样品的终体积比总是 3：1。
3. 将样品剧烈震荡混匀后，在室温静置 5 分钟以使核蛋白体完全分解。
4. 加 0.2 ml 氯仿，剧烈振荡 15 秒并室温静置 2 分钟。
5. 于 4℃ 13,000 rpm 离心 10 分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA 存在于水相中。水相层的容量大约为所加 溶液 A体积的 60%，把水相转移到新管中，进行下一步操作。
6. 加入 0.5 倍体积无水乙醇，颠倒混匀（此时可能会出现沉淀）。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱 RA 中（吸附柱套在收集管内）。
7. 室温（以下步骤均为室温）13,000 rpm 离心 30 秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。
8. 加 500 μl 柱式血液 RNAout 溶液 B，12,000 rpm 离心 30 秒，弃掉废液。
9. 加入 500 μl 漂洗液 RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心 15 秒，弃掉废液。
10. 重复一遍步骤 8。
11. 将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm 离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
12. 取出吸附柱 RA，放入一个 RNase free 离心管中，根据预期 RNA 产量在吸附膜的中间部位加 30-50μl RNase free water（事先在 65-70℃水浴中加热效果更好）， 室温放置 2 分钟，13,000 rpm 离心 1 分钟。如果需要较多 RNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心 1 分钟，,或者另外再加 30μl RNase free water，离心 1 分钟，合并两次洗脱液。
13. 如果需要 RNA 浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积最好不少于 30μl，体积过小降低 RNA 洗脱效率，减少 RNA 产量。
注意事项
1. 第一次使用前请先在漂洗液 RW 瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
2. 本试剂盒抑制 RNA 酶效果极佳，所有离心步骤如未加说明，均可在常温进行。
3. 柱式血液 RNAout 溶液 A 和柱式血液 RNAout 溶液 B 中含有刺激性有害化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
4. 考虑到环保问题，本试剂盒不含有实验室常用试剂氯仿，使用前需要自备氯仿。
5. 常规的琼脂糖凝胶电泳和变性胶电泳均可以用来分析 RNA 的质量。好的 RNA 产物在电泳后应该可以看到明显的二条优势核糖体 RNA 带，分别为~5Kb（28S），~2Kb
（18S），条带亮度比值约为 2：1。有时候也可以看到~0.1kb 和 0.3Kb(5S，tRNA)带。但有时候根据不同的物种如某些植物组织可以看到 4，5 条带也属于正常现象，如果 RNA 未成熟的前体或者不均一核 RNA、小核 RNA 提取出来也可能看到介于 7Kb和 15Kb 之间的不连续的高分子量条带。
6. 检测 OD260/OD280 吸光度比值时，如需稀释 RNA 样品应该用 TE（PH 8)，如果用水稀释后检测，由于一般水离子强度和 PH 值低，会使 OD280 升高，从而使比值降低。
7. 加入柱式血液 RNAout 溶液 A 匀浆后，加氯仿前，样品可在 –60℃-70℃ 保存一个月以上。
8. 若提取细菌 RNA，推荐 EASYspin 系列细菌 RNA 提取试剂盒。
