三、添加模板-第一步反应(模板添加区)
向 PCR 管中分别加入 5 μL 模板,顺序为阴性对照(DEPC-H2O)、待测样品模板、诺如病毒 GI 群聚合酶-衣壳双基因片段(RegionB-C)RT-PCR 阳性对照,离心 30 秒,立即进行扩增反应。
四、扩增反应-第一步反应(扩增及产物分析区) 将 PCR 管放置在 PCR 扩增仪器样品槽相应位置,进行扩增,扩增程序如下:
五、试剂配制-第二步反应(试剂准备区) 准备足量的 PCR 管(样品管、阴性对照管、阳性对照管),向各 PCR 管中分别加入 下列成分。
六、添加模板-第二步反应(模板添加区) 向 PCR 管中分别加入 5 μL 第一步反应产物,离心 30 秒,立即进行扩增反应。
七、扩增反应-第二步反应(扩增及产物分析区) 将 PCR 管放置在 PCR 扩增仪器样品槽相应位置,进行扩增,扩增程序如下:
八、电泳检测 分别取第一步反应和第二步反应各 5-10 μL RT-PCR 产物。电泳检测巢式 RT-PCR 产 物。
本产品提供的扩增反应液含染料,在扩增结束后可以直接上样,不需要另外再加 loading buffer。
阳性对照结果:凝胶电泳图谱中第一步反应有 313bp 大小的条带,第二步反应有 250bp 大小的条带。 阴性对照结果:凝胶电泳图谱中第一步反应和第二步反应均无条带。
样本检测结果:凝胶电泳图谱中第一步反应出现 313bp 或第二步扩增出现 250bp 大 小条带,结果判定为阳性;若第二次反应扩增无条带或者在 250bp 大小位置上无条带, 则判定为阴性。
诺如病毒GI群聚合酶衣壳双基因片段(RegionB-C)巢式RT-PCR试剂盒