上海细胞库
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| 规格 | 价格 | 库存 |
|---|---|---|
| 5×10^5Cells/Vial | ￥ 3500 | 11 |
一、人椎间盘髓核细胞原代永生化培养条件
| 年龄性别 | 58Y;Male | ||
| 组织来源 | 椎间盘组织 | 细胞类型 | 肿瘤细胞 |
| 细胞背景 | 人椎间盘髓核细胞原代永生化是原代人椎间盘髓核细胞经慢病毒转染的方式携带SV40T基因，经抗生素和传代筛选获得。人椎间盘髓核细胞分离椎间盘组织；椎间盘是位于脊柱两椎体之间，分为中央部的髓核，富于弹性的胶状物质；周围部的纤维环，由多层纤维软骨环按同心圆排列。上下有软骨板，是透明软骨复盖于椎体上，下面骺环中间的骨面。上下的软骨板与纤维环一起将髓核密封起来。纤维环由胶原纤维束的纤维软骨构成，位于髓核的四周。纤维环的纤维束相互斜行交叉重叠，使纤维环成为坚实的组织，能承受较大的弯曲和扭转负荷。髓核，是乳白色半透明胶状体，富于弹性，为椎间盘结构的一部分，位于两软骨板与纤维环之间。由纵横交错的纤维网状结构即软骨细胞和蛋白多糖黏液样基质构成的弹性胶冻物质。婴幼儿时期的髓核含水量为80%-90%，即使到了老年，其含水量也在70%上下。髓核在出生时体积大而松散，位于椎间盘的中央，至成年时位置移至椎间盘的中后部；在成年以前构成髓核的主要物质是大量蛋白多糖复合体、胶原纤维和纤维软骨，随着年龄的增长，髓核中的蛋白多糖解聚增多，水分逐渐减少，胶原增粗并逐渐被纤维软骨所替代。 人椎间盘髓核细胞原代永生化体外培养周期有限；建议使用普诺赛配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。 | ||
| 传代方法 | 1:2~1:4 | 传代情况 | 2-3次/周 |
| 备注 | 本库的细胞仅用于科研工作，未经许可不得用于其他目的，使用者不得将本库细胞转让给第三者。 | ||
二、人椎间盘髓核细胞原代永生化收货后处理
复苏细胞处理方法：培养至良好状态后灌满完全培养液并封好瓶口是运输细胞的最好办法。收到细胞用75%酒精喷洒整个细胞瓶，严格无菌后将细胞瓶放置培养箱中静置2-4小时以稳定细胞状态。静置后显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照保存（最好40x,100x,200x各一张），前三天照片是重要售后依据，不提供照片默认收到状态良好。
冻存细胞处理方法：收到细胞后，观察泡沫箱中干冰是否有剩余，冻存管是否完好无损是否有解冻情况，若发现干冰完全汽化或冻存管有解冻破损现象，请及时拍照并与我们联系。如果细胞签收三天内未与我们联系，则默认为收货良好。复苏第一管如有活性问题，请及时联系我们，技术人员与您沟通指导后再复苏第二管，未与我方联系擅自复苏第二管出现问题不予售后。
细胞培养步骤
a、细胞传代：如果未超过80%汇合度时，将瓶装的完全培养液收集至离心管中，留5ml完全培养基，放入37℃、5%CO2孵箱培养；如果细胞密度超80%，即可进行传代培养。
贴壁细胞步骤如下：
1) 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次；
2) 加1mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置培养箱中消化 1min ，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后，加6ml含10%血清的完全培养基终止消化；
3) 轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出至离心管中，1000 rpm离心5-8min，弃去上清液，补加1-2mL完全培养基后吹匀；
4) 按5-6mL每瓶补加完全培养基，将细胞悬液按1:2的比例分到新的含5-6 mL完全培养基的6cm培养皿中或者T25培养瓶中。
（即1个T25瓶传代接种至2个T25瓶或者2个6cm的培养皿）
悬浮细胞传代步骤如下：
1、半换液法
半换液处理，竖着培养瓶在培养箱静置1小时左右，轻轻吸掉3ml左右培养基，然后补给3ml的完全培养基，如果培养基变色慢，可直接加500ul左右FBS，传代的时候可以直接补给5ml培养基 分两个培养瓶培养，一般这样传代3次左右可以离心传代一次，去掉死细胞。
2、离心换液法
如需分瓶可以将细胞悬液收集到离心管中1000rpm，离心5min，弃去上清，补加1-2mL培养液后重悬混匀后将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。
b、细胞冻存：
1、细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃T25培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；
2、添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心 5min；
3、 弃上清，沉淀细胞加入1ml的雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管中。
4、 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱即可，如后期要将细胞转入液氮罐中，则需在-80℃冰箱 中存放24小时以上再转入液氮罐中。
C、细胞复苏：
1、从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），快速将其置入 37℃水浴中解冻， 直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁；
2、将冻存管中的细胞移至含 5ml 完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；
3、弃上清，沉淀用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养；
4、第二天，换用新鲜完全培养基继续培养。
人椎间盘髓核细胞原代永生化注意事项：有些细胞贴壁不牢，在运输过程中容易发生细胞脱落，这是正常现象。如脱离较多可将培养瓶所有培养液收集至离心管，1000rpm离心5min，收集上清作过渡培养（后期对比培养），沉淀加入胰酶1-2ml，轻轻吹打，重悬，消化1-2分钟后，加5ml完全培养基终止反应。再离心，弃上清，加1-2ml完全培养基重悬。然后按1:2比例进行分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃,5%CO2细胞培养箱中培养
