正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
ACL（EC4.1.3.8）是脂肪酸合成中的关键酶，其催化产生的乙酰辅酶 A 可用于脂肪酸合成 和碳链延长、黄酮类物质合成、氨基酸合成等。
测定原理：
ACL 在 ATP 和辅酶 A 存在的情况下催化柠檬酸裂解为乙酰辅酶 A、草酰乙酸、腺苷二磷酸 和磷酸盐。苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和 NADH 生成苹果酸和 NAD+，在 340nm 测
定 NADH 减少速率，计算 ACL 活性。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水
试剂组成和配制：
提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：液体 5μL×1 支，4℃保存；
样本的前处理：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量 （104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提
取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定
（1）工作液的配置，将试剂二和试剂三转移至试剂一中，充分混合溶解，置于 37℃（哺乳 动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min；（注意：可取少量试剂一至试剂二和试剂三中，充
分混匀溶解后转移至试剂一瓶中，重复 2-3 遍）；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复 冻融。
（2）在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 样本和 950μL 工作液，混匀，立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 2min20s 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。
ACL 活性计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清（浆）ACL 活力计算
单位定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
ACL（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷V 样÷T=1608×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 ACL 活力计算
（1）按样本蛋白浓度计算
单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
ACL（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(V 样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
ACL（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=1608×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每 1 万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
ACL（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=3.216×ΔAV 反总：反应体系总体积，1×10-3 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
文献参考：文章标题：GSK-3β at the Crossroads in Regulating Protein Synthesis and Lipid Deposition in Zebrafish
影响因子：5.656
期刊：Cells
作者列表：Yaqi Gu, Lili Gao, Qiang Han, Ao Li, Hairui Yu, Dongwu Liu, Qiuxiang Pang
发表时间：2019-2-28
DOI:10.3390/cells8030205
