产品分类/PRODUCT CLASSIFICATION
| 规格 | 价格 | 库存 |
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| 10次 | ￥ 3000 | 10 |
| 产品及特点 | DNA Shuffling 即DNA 分子的体外同源重组，它是一种分子水平上的定向 进化(directed evolution)技术，它以一个或多个基因为起始材料，通过先随机 断裂成小片段，再进行互为模板和引物的 PCR（无外加引物）， 最后再进行常规 PCR（外加引物）等处理，最后得到含有大量 DNA 重组突变的 PCR 产物。其 原理示意图如下：
本产品就是根据上述原理优化改进而成，它具有下列特点： 1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板 ，无需单独准备各成分。 2. 可以用于对长度在 1000bp 的同源片段进行 shuffling。 3. 操作手册经过优化， 1-2 天即可完成，节省大量优化时间。 4. 本产品足够 10 次 DNA Shuffling 反应，只适用于科研，不能用于临床。 | |||||
| 规格及成分 |
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| PCR MagicMix | 90805 | 1 mL×3 |
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| DNase I 溶液（0.1U/μL） | 90903a | 10 μL |
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| DNA Shuffling 试剂盒溶液 A ， 10× | 131178a | 100 μL |
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| DNA Shuffling 试剂盒溶液 B ，10× | 131178b | 100 μL |
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| 超纯水 | 100935 | 1 mL |
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| 使用手册 | 131178sc | 1份 |
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| 运输及保存 | 低温运输 ，-20℃保存 ，保存期限一年。 | |||||
| 自备试剂 | 待突变基因片段、DNA Shuffling 引物（第二轮 PCR 引物）、胶回收试剂盒。 | |||||
| 使用方法 | 1. 提前开启 37℃和 75℃水浴或金属浴。 2. 待突变基因片段的制备：待突变基因片段可以用多个含同源片段的质粒为模 板、用 PCR 法或酶切法制备。制备时需保证含起始同源片段（或此同源片 段的一部分）的 DNA 片段总长度要比 DNA shuffling 终产物（第二轮 PCR 产物）长 200-400 bp ，即第二轮 PCR 的引物位置要在此步模板制备引物 内侧 100-200bp ，第二轮 PCR 产物的长度在 1000bp 以下 。每次 DNA Shuffling 实验至少需要 2 μg 起始同源片段（如果含两个以上同源片段， 则彼此的比例为 1:1:1），最多可以使用 5 μg 起始同源片段，并且必须通过 胶回收的方法回收，以便彻底去除残留的质粒模板、引物和非特异扩增产物 等（如果不去除此步的引物，其将对后续 PCR 造成严重干扰）。最后需用分 光光度法准确定量 ，此溶液即为同源片段 ，放冰上待用。 3. 准备 DNaseI 工作液，将 1 μL 本试剂盒提供的 DNaseI 溶液、8uL 超纯 水、 1 μL DNA Shuffling 试剂盒溶液 A 混合得 DNase 工作液 ，放冰上待 用 。DNase 工作液必须现配现用。 4. 设置同源片段碎片化反应：在一个 PCR 管中，按顺序加入下列成分：
5. 充分轻柔吹打混匀后 37℃水浴 8 分钟，然后立即放 75℃水浴处理 10 分钟 以灭活 DNase I。 6. 在 2-3%琼脂糖凝胶上电泳，用常规的胶回收法回收 25-150 bp 范围的所 有片段，分光光度法精确测定回收片段的浓度。此即为回收片段，放冰上待 用。注意：一定要加合适的 DNA marker 以便确定片段范围。 7. 回收片段重组反应：在一干净 PCR 管中加入 0.5 μg 回收片段、50 μL PCR Mix 3.0、补加超纯水到 100 μL 。反应总体积为 100 μL 8. 按下面的 PCR 反应参数进行第一轮无引物 PCR： | ||||||||||||||||
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| 过程 | 温度 | 时间 | |||||||||||||
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| PCR 前变性 | 94℃ | 150 s | |||||||||||||
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PCR 反应 （40 循环） | 94℃ | 30 s | |||||||||||||
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| 47.5℃ | 45 s | |||||||||||||
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| 72℃ | 10 s，每次循环后增加 5s | |||||||||||||
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| PCR 后延伸 | 72℃ | 10 min |
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| 9. 取 5-10 μL 进行电泳检测（本 PCR Mix 含上样成分，可以直接上样。红色 示踪剂的泳动速度相当于 50bp DNA），然后对预期长度区域的 PCR 产物 进行回收（如果 Shuffling 的同源区域长度为 800bp，则回收 600-1000bp 范围的片段），得到第一轮 PCR 回收产物。 10. 留部分第一轮 PCR 回收产物之后，用超纯水将其分别稀释 10 倍、20 倍和 50 倍 ，放冰上待用。 11. 取第一轮 PCR 回收产物原液、 10 倍稀释液、20 倍稀释液和 50 倍稀释液 各 1uL 作为PCR 模板，按下表设置 4 管第二轮 PCR 反应（100μL 体系）。
12. 按下列 PCR 参数进行 PCR：
13. 电泳检测 4 个 PCR 产物，回收预期大小的 PCR 产物（根据引物位置估计 预期大小），用于后续克隆和分析实验（略）。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| 答客问 | Q：易错 PCR 和 DNA Shuffling 有何区别？ A：前者引入的是点突变，后者引入的是重组突变。示意图如下： |
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| 关联产品 | 即用型易错 PCR 试剂盒 | |||||||||||||||||||||||||||||||
