产品及特点
本试剂盒可用于检测苜蓿黄萎病菌。黄萎轮枝孢的寄主植物很广泛，但侵染苜蓿的菌
系寄主较少，且各地菌株的致病性不一致。北美分离菌株主要为害苜蓿，也侵染马铃薯、
蚕豆、草莓、冠状岩黄芪和红花菜豆等，并表现症状。羽扇豆、豌豆、红三叶、白三叶、
草木犀、驴喜豆、大豆、罗马甜瓜、茄子、忽布、西瓜等带菌，但不表现症状。
本产品是根据探针法荧光定量 PCR 原理开发的苜蓿黄萎病菌检测试剂盒，
它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。
2. 引物等组分经过优化，灵敏度高。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据苜蓿黄萎病菌 DNA 序列高度保守区设计，不会跟其他生物样本的 DNA 发生交叉反应。
5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为 5 个数量级。
6. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。
7. 本产品只能用于科研。
使用方法
一、DNA 提取(样本制备区)
1. （选做）如果有 N 个样品待提取，最好设置 N+2 个提取，多出的是 PC（样品制备阳性对照）和 NC（样品制备阴性对照）。可以取阳性对照的 1000 倍稀释液 10μL 再加上一定量的水，使总体积与待提取样品的规定体积一致，以此作为 PC。另外用水作为
NC。
2. 用自选方法提取纯化样品 DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼
容。
二、稀释标准曲线样品(样本制备区)
（由于阳性对照浓度高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，避免污染样品或本试剂盒的其他成分）。
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光模板稀释液，（最好用带芯枪头，下同）。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。 若无需制作标准曲线，将阳性对照稀释到 1×10E5 拷贝/μL 即可。
三、试剂配制(试剂准备区)
准备足量的 PCR 管(样品管、阴性对照管、阳性对照管)，向各 qPCR 管中分别加入
下列成分。成分 N 个待
结果分析
1. 如果制作标准曲线，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，推算出其浓度。
2. 如果未制作标准曲线，按照如下标准判定结果：阳性对照（1×10E5 拷贝/μL）结果：Ct 值<30，有明显指数增长，呈典型的 S 型曲线。阴性对照结果：Ct 值>40 或无 Ct 值，无明显指数增长期和平台期。样本检测结果：Ct 值<38，有明显指数增长，表明样本中检测出苜蓿黄萎病菌，结果为阳性；Ct 值>40 或无 Ct 值，表明样本中未检测出苜蓿黄萎病菌，结果为阴性；Ct值在 38-40 范围，应对样本进行复检，如重复实验结果 Ct 值仍在 38-40 范围，有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。
