背景资料

• 细胞名称: THP-1

• 组织来源: 人急性单核细胞白血病

• 细胞类型: 单核细胞

• 生长特性: 悬浮生长

• 特征描述: THP-1细胞是一种常用的人单核细胞系，可诱导分化为巨噬细胞样细胞，广泛应用于免疫学、炎症反应和肿瘤坏死因子（TNF）信号通路研究。

• TNFR1和TNFR2基因功能:

  • TNFR1（TNF受体1，又称TNFRSF1A）：介导TNF-α的促炎和促凋亡信号。

  • TNFR2（TNF受体2，又称TNFRSF1B）：主要参与TNF-α的免疫调节和细胞存活信号。双基因敲除THP-1细胞可用于研究TNFR1和TNFR2在炎症、免疫调节和细胞凋亡中的独立及协同作用。

  • 转导方法

    • 敲除方法: CRISPR/Cas9基因编辑技术

    • 载体系统: 使用lentiCRISPR v2载体，分别包含Cas9蛋白和靶向TNFR1及TNFR2基因的sgRNA。

    • 转导方式: 慢病毒转导

    • 筛选标记: Puromycin抗性基因（通过Puromycin筛选稳定敲除株）。

    ---

    修饰类型

    • 基因修饰类型: 双基因敲除（Double Knockout, DKO）

    • 修饰目标: TNFR1和TNFR2基因完全敲除，导致TNFR1和TNFR2蛋白表达缺失。

    ---

    修饰基因

    • 靶基因1: TNFR1（TNF受体1，TNFRSF1A）

      • 基因ID: ENSG00000067182

      • 敲除位点: 针对TNFR1基因的外显子区域设计sgRNA。

    • 靶基因2: TNFR2（TNF受体2，TNFRSF1B）

      • 基因ID: ENSG00000186827

      • 敲除位点: 针对TNFR2基因的外显子区域设计sgRNA。

    • 验证方法:

      • 测序: 确认TNFR1和TNFR2基因靶位点的插入或缺失（Indel）。

      • Western Blot: 检测TNFR1和TNFR2蛋白表达缺失。

      • 功能验证: 通过TNF-α刺激实验验证TNFR1和TNFR2信号通路活性缺失。

    ---

    培养条件

    • 培养基: RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 青霉素/链霉素

    • 培养温度: 37°C, 5% CO2

    • 传代比例: 1:3至1:6，每2-3天传代一次

    • 冻存液: 90% FBS + 10% DMSO

    ---

    应用领域

    • TNF信号通路研究

    • 炎症反应机制研究

    • 免疫调节研究

    • 细胞凋亡研究

    • 药物筛选和药效评估

    ---

    质量控制

    • 无菌检测: 阴性

    • 支原体检测: 阴性

    • STR鉴定: 通过

    • 敲除效率验证: 通过测序和Western Blot确认TNFR1和TNFR2基因敲除。

    • 细胞收到后处理

      细胞在培养瓶中培养至良好状态后灌满完全培养液并封好瓶口是细胞运输的最好办法。收到细胞回到自己的实验室后，先打开外包装，用75%酒精喷洒整个瓶消毒后放到超净台内，严格无菌操作，培养箱静置2-4小时。镜下观察：未超过80%汇合度时，可将瓶装的完全培养液收集至离心管中，加入6ml完全培养基，放入37℃、5%CO2孵箱培养；超过80%汇合度时，根据情况传代或者冻存，具体操作见细胞培养步骤。（注意发货的是密封培养瓶的话，放入培养箱培养记得培养瓶盖子拧松，传代后建议一瓶用原瓶里面的完全培养基，另外一瓶用自己配的完全培养基）

      细胞培养步骤

      一、复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

      二、细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

      a）、对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

      1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

      2. 加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

      3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

      4. 按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

      b）、对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：

      方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心8-10分钟，弃上清液，补加1-2ml培养液后吹匀，将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或瓶中。

      方法二：可选择半数换液方式，弃半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培养基新皿中或者瓶中。

      PS：若客户收到2ml小管细胞，收到细胞后，用75%酒精喷洒整个管子消毒后放到超净台或安全柜内，严格无菌操作；将小管细胞转移至T25培养瓶或6cm培养皿，加入5ml左右完全培养基混匀，放入培养箱过夜培养后查看细胞密度：若密度未超过80%，换液继续培养，视情况传代或者冻存。若密度超过80%，可直接进行传代（方法同上）。

      三、细胞冻存：（注：非无血清冻存液方法，无血清冻存液方法请参考我司官网货号：C7001）

      1、细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

      2、添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

      3、用适量的冻存液重悬细胞，并放置于冻存管中；

      4、先将细胞冻存管放置于-20℃ 1.5h，然后将其移入-80℃。