背景资料

• 细胞名称: BT-549

• 组织来源: 人乳腺导管癌

• 细胞类型: 上皮细胞

• 生长特性: 贴壁生长

• 特征描述: BT-549是一种三阴性乳腺癌（TNBC）细胞系，缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和HER2表达，常用于研究乳腺癌的侵袭性、转移机制及药物敏感性。

• PDK1基因功能: PDK1（3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1）是PI3K/AKT信号通路中的关键激酶，参与细胞生长、代谢和存活调控。PDK1基因敲除可用于研究其在肿瘤发生、代谢重编程和耐药性中的作用。

• 转导方法

  • 敲除方法: CRISPR/Cas9基因编辑技术

  • 载体系统: 使用lentiCRISPR v2载体，包含Cas9蛋白和靶向PDK1基因的sgRNA。

  • 转导方式: 慢病毒转导

  • 筛选标记: Puromycin抗性基因（通过Puromycin筛选稳定敲除株）。

  • 修饰类型

    • 基因修饰类型: 基因敲除（Knockout, KO）

    • 修饰目标: PDK1基因完全敲除，导致PDK1蛋白表达缺失。

    • 修饰基因

      • 靶基因: PDK1（3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1）

      • 基因ID: ENSG00000152256

      • 敲除位点: 针对PDK1基因的外显子区域设计sgRNA，确保基因功能完全丧失。

      • 验证方法:

        • 测序: 确认靶位点基因序列的插入或缺失（Indel）。

        • Western Blot: 检测PDK1蛋白表达缺失。

        • 功能验证: 通过PI3K/AKT信号通路活性检测（如p-AKT水平）验证PDK1敲除效果。

        • 应用领域

          • PI3K/AKT信号通路研究

          • 肿瘤代谢研究

          • 乳腺癌侵袭和转移机制研究

          • 药物敏感性及耐药性研究

          • 基因功能研究

          • 质量控制

            • 无菌检测: 阴性

            • 支原体检测: 阴性

            • STR鉴定: 通过

            • 敲除效率验证: 通过测序和Western Blot确认PDK1基因敲除。

            • 细胞收到后处理

              细胞在培养瓶中培养至良好状态后灌满完全培养液并封好瓶口是细胞运输的最好办法。收到细胞回到自己的实验室后，先打开外包装，用75%酒精喷洒整个瓶消毒后放到超净台内，严格无菌操作，培养箱静置2-4小时。镜下观察：未超过80%汇合度时，可将瓶装的完全培养液收集至离心管中，加入6ml完全培养基，放入37℃、5%CO2孵箱培养；超过80%汇合度时，根据情况传代或者冻存，具体操作见细胞培养步骤。（注意发货的是密封培养瓶的话，放入培养箱培养记得培养瓶盖子拧松，传代后建议一瓶用原瓶里面的完全培养基，另外一瓶用自己配的完全培养基）

              细胞培养步骤

              一、复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

              二、细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

              a）、对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

              1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

              2. 加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

              3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

              4. 按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

              b）、对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：

              方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心8-10分钟，弃上清液，补加1-2ml培养液后吹匀，将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或瓶中。

              方法二：可选择半数换液方式，弃半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培养基新皿中或者瓶中。

              PS：若客户收到2ml小管细胞，收到细胞后，用75%酒精喷洒整个管子消毒后放到超净台或安全柜内，严格无菌操作；将小管细胞转移至T25培养瓶或6cm培养皿，加入5ml左右完全培养基混匀，放入培养箱过夜培养后查看细胞密度：若密度未超过80%，换液继续培养，视情况传代或者冻存。若密度超过80%，可直接进行传代（方法同上）。

              三、细胞冻存：（注：非无血清冻存液方法，无血清冻存液方法请参考我司官网货号：C7001）

              1、细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

              2、添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

              3、用适量的冻存液重悬细胞，并放置于冻存管中；

              4、先将细胞冻存管放置于-20℃ 1.5h，然后将其移入-80℃。