线粒体超氧化物检测试剂盒(MitoSOX Red) (Mitochondrial Superoxide Assay Kit with MitoSOX Red)是一种以MitoSOX Red为荧光探针，快速灵敏地检测线粒体内超氧化物变化的试剂盒。本试剂盒可使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光酶标仪、流式细胞仪等荧光检测系统进行检测。

超氧化物通常指超氧化物阴离子(Superoxide anion) O2·-，是一种氧分子的自由基。在呼吸链中，NADPH氧化酶把电子传递给氧分子的时候，就会产生超氧化物阴离子O2·-。超氧化物阴离子O2·-是一种强氧化剂，可以由被刺激的白细胞等产生，从而抵御微生物的感染等。超氧化物阴离子O2·-也可以导致氧化损伤，和许多疾病的发生密切相关[1-3]。

MitoSOX Red，简称MSR，也称MitoSOX、Mito-HE，分子量为759.7，分子式为C43H43IN3P，是一种新型的用于线粒体内超氧化物检测的荧光探针，其可快速、特异性地靶向线粒体，从而有选择性地检测线粒体内的超氧化物。MitoSOX Red是带有阳离子三苯基磷酸基团的二氢乙锭衍生物。二氢乙锭(Hydroethidine, HE)可以被活性物质(如超氧化物)氧化为乙锭，然后与DNA结合产生荧光。MitoSOX Red显示出同样的特性，可被超氧化物迅速氧化，但不被其它活性氧(Reactive oxygen species, ROS)和活性氮(Reactive nitrogen species, RNS)氧化，氧化产物结合核酸后，产生强荧光[4-6]。

本试剂盒检测线粒体内超氧化物的原理如图1所示。MitoSOX Red的磷酸基团上的正电荷被三个亲脂苯基包围，从而有助于其进入活细胞并选择性地靶向进入线粒体，最终可以被超氧化物氧化。被氧化的MitoSOX Red与线粒体内核酸结合，产生强烈的红色荧光，MitoSOX Red有两个激发峰，分别约为396nm和510nm，发射波长约为580nm。396nm的激发峰在其它活性氧(ROS)产生的乙锭类氧化产物的激发光谱中不存在，因此选择在396nm进行激发，可能对于线粒体超氧化物的检测更为特异[5-6]。

图1.线粒体超氧化物检测试剂盒(MitoSOX Red) (S0061)检测原理图。

本试剂盒提供的MitoSOX Red为5mM储存液。本试剂盒推荐的最终使用浓度经过优化，对大多数细胞都适用，但为了得到更满意的结果，对于不同类型的细胞请自行进行一定摸索，MitoSOX Red的终浓度通常为1-5μM，最优先的推荐终浓度为5μM。过量MitoSOX Red在线粒体积累会造成细胞损伤，因此MitoSOX Red的工作浓度不能超过5μM，否则可能会产生细胞毒性，例如改变线粒体形态，MitoSOX Red重新分布到胞核或胞质中等。同时，本试剂盒提供的mSoxUp作为诱导细胞线粒体内超氧化物生成的阳性对照，终浓度通常为0.5-2X，最优先的推荐终浓度为1X。使用本试剂盒检测细胞线粒体内超氧化物的效果参考图2和图3。

图2.粒体超氧化物检测试剂盒(MitoSOX Red) 检测L929细胞(小鼠成纤维细胞)线粒体内超氧化物的荧光显微镜效果图。L929细胞不处理或用阳性对照试剂mSoxUp处理后，使用本试剂盒和Hoechst 33342以及Mito-Tracker Green进行染色。正常的L929细胞中未氧化MitoSOX Red，细胞中红色荧光非常弱，几乎观察不到红色荧光；使用诱导线粒体内超氧化物生成的阳性对照试剂mSoxUp处理后，线粒体内超氧化物生成增加，MitoSOX Red与超氧化物反应并重新分布，与线粒体及细胞核DNA结合，细胞中线粒体及细胞核的红色荧光显著增强[7]。蓝色荧光为Hoechst 33342标记的所有细胞的细胞核。绿色荧光为Mito-Tracker Green标记的所有细胞的线粒体。本试剂盒中不提供Hoechst 33342和Mito-Tracker Green，如有需要，可向订购Hoechst 33342染色液、Mito-Tracker Green 。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

图3线粒体超氧化物检测试剂盒(MitoSOX Red) 检测L929细胞(小鼠成纤维细胞)线粒体内超氧化物的流式细胞术效果图。L929细胞不处理或用阳性对照试剂mSoxUp处理后，使用本试剂盒进行染色并进行流式细胞术检测。正常的L929细胞中未氧化MitoSOX Red，细胞中红色荧光非常弱；使用诱导线粒体内超氧化物生成的阳性对照试剂mSoxUp处理后，线粒体内超氧化物生成增加，细胞中的红色荧光显著增强。分别通过PE (Ex/Em=561/585)和Violet610 (Ex/Em=405/610)通道进行检测，Violet610通道信号更强一些但对照组的背景信号也更强一些，此时可能具有更好的特异性。参考细胞的荧光照片，类似的PE (Ex/Em=561/585)通道进行检测，此时具有更好的信噪比。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

本试剂盒小包装和中包装，MitoSOX Red (5mM)按照1:1000的比例稀释，6孔板每孔检测体系为1ml时，可以分别进行20和100次检测；96孔板每孔检测体系为100μl时，可以分别检测200和1000次。

包装清单：

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。MitoSOX Red (5mM)须避光保存，-80ºC保存效果更好。

注意事项：

BSA和酚红(Phenol red)对本荧光探针的检测有干扰，需避免。

荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

根据文献报道，MitoSOX Red在与超氧化物反应后可能会重新分布，并与线粒体或细胞核DNA结合[7]，因此可以观察到红色荧光集中在细胞核。

本试剂盒仅限于进行存活的细胞或组织的检测，不可用于固定或冻存的细胞或组织样品的检测。

荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，推荐使用全黑96孔细胞培养板或黑色透明底96孔细胞培养板。

第一次使用时请分装成小包装后-20ºC保存，以避免反复冻融。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。