CHOK1-Dog-SIRPA-上海雅吉生物科技有限公司

一、产品详情

传代方法	1:2~1:4传代，每2～3天传代或换液一次。	冻存条件	细胞库无血清冻存液
细胞描述	本库的细胞仅用于科研工作，未经许可不得用于其他目的，使用者不得将本库细胞转让给第三者。
细胞备注	用无菌离心管收集瓶子培养基，留作过渡培养

二：如何构建稳转细胞株

构建一个稳转细胞株的方法有质粒直接转染然后用抗生素筛选、慢病毒转染然后筛选以及转座子转染筛选等方法。其中慢病毒转染法由于转染效率高，只要转染成功得到的细胞都是稳定整合到基因组的，用于稳转细胞株构建时阳性率和稳定性都有其他方法无法比拟的优点。虽然慢病毒在转染前的准备工作比其他方法步骤多，但是比起给后续细胞筛选中节省的时间和精力，以及得到的稳转细胞株的稳定性，这些前期的准备步骤都是值得的。

步骤一、慢病毒包装

包装慢病毒需要以下3个部分：

1、慢病毒载体——表达目的基因、实现功能。慢病毒载体中的一部分将稳定整合到细胞基因组中，实现过表达目的基因、RNA干扰特定基因或者其他研究者指定的功能。

2、包装载体——包装载体中含有病毒衣壳蛋白、核心蛋白等产生病毒颗粒所必须的元件，提供病毒包装过程中必不可少的辅助元件。

3、包装细胞——包装细胞通常是HEK293T细胞。我们可以理解为生产病毒的场所或者工地。慢病毒载体和包装载体进入包装细胞后就可以生产病毒了。

病毒包装过程可以简单描述为将慢病毒载体和包装载体共同转入包装细胞，收集细胞培养上清（病毒悬液），然后就得到可以用于感染目标细胞的病毒了。

在这里就不对包装操作详细的重新叙述一遍了。下面总结一些关于病毒包装的常见问题。

1、包装前需要准备什么？

首先，所有用于病毒包装的质粒都必须制备为转染级的无内毒素质粒，推荐浓度大于0.5ug/ul。质粒质量关系到包装效率，切勿用普通试剂盒提取。

其次，准备好状态良好的包装细胞。这是提高转染效率和病毒产量的关键。

2、慢病毒包装需要多长时间？

从细胞转染到收集完毕病毒需要72小时。

3、收集到的慢病毒悬液可以直接用于转染细胞吗？病毒需要纯化吗？

这个问题的答案其实决定于您包装病毒后的下游实验，以及病毒包装的外源基因。病毒纯化可以提高病毒浓度和转染效率。如果您要包装的目的基因较小（外源片段越小，包装效率越高）、细胞容易转染，那么不纯化病毒也可以获得满意的转染效果。如果外源基因较大或者细胞难以转染，那么浓缩纯化就是必不可少的。推荐一下我们的慢病毒纯化试剂，无需高速离心就能实现病毒浓缩纯化。

4、为什么表达GFP融合蛋白的荧光低/看不见？是病毒包装失败了吗？

即使瞬时转染，一般融合蛋白中的GFP标签亮度也显著低于单独的GFP蛋白。可能与融合蛋白的表达量下降以及蛋白折叠效果有关。在慢病毒包装和转染中，荧光降低还因为病毒包装效率有关。随着外源基因片段增大，病毒的包装效率会显著降低。叠加上很多细胞的表达效率也远不及293细胞，就会出现细胞筛选到抗药的阳性细胞，但荧光极低甚至看不见的情况。并不是病毒包装失败了。但是这种现象也表明，有可能目的蛋白表达量低，需要用WB等方法进一步验证。如果确实低，则可以考虑换用启动子等方法改进表达量。

步骤二、慢病毒转染细胞

将慢病毒直接加入细胞的培养基中，病毒就能完成细胞转染。病毒量少了，转染得到的阳性细胞当然会少。但是与一般转染试剂不同的是，病毒量多了，细胞却不会死亡或者其他不利的副作用。所以只需要保持加入的病毒液量低于10%（太多可能会改变培养基成分，影响细胞的生长）即可。对于一些较难转染的细胞，加入辅助试剂polybrene，可以协助病毒转染。

当然，在正式实验前，我们建议您用GFP荧光蛋白表达的慢病毒先转染一次，对细胞的转染效率、表达效率以及筛选要点先进行一次预实验。

一般24小时后，病毒载体上的基因就可以在细胞内开始表达。EGFP等荧光蛋白报告基因可以在转染后48小时被观察到，这时就可以加入抗生素对阳性细胞进行筛选了。

步骤三、细胞筛选

我们公司的慢病毒载体大多数带有puromycin抗性标签。通常采用添加puromycin抗生素，杀死未转染成功的细胞来筛选阳性细胞。对于表达荧光或者其他容易辨识的标记的细胞，也可用流式细胞仪进行快速筛选。

对于HEK293细胞而言，我们使用的puromycin筛选浓度为2ug/ml。筛选3天即可观察到绝大部分未转染细胞死亡。筛选1-2周，阳性细胞就能稳定增值，形成多克隆细胞株。当然，为了保持高表达细胞在多克隆细胞株中生长占优势，有必要在培养基中添加嘌呤霉素1 ug/ml进行维持。