产品概述：hPSC-心肌细胞是从人类多能干细胞（hPSC）分化得来，该细胞具有搏动能 力，能表达心肌细胞的特异性 Marker（如 cTNT 等）

需要材料：1.DPBS, No Calcium, No Magnesium  2.RPMI1640    3.FBS

细胞传代：CM 不能增殖，当有实验需求时可按培养器皿底面积 1:1 比例接种传代

培养操作（以六孔板 1 孔为例）

1）复苏细胞：将含有 1 mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加 4 mLCM 维持培养基（含 10μM IMC-014-Y）混合均匀。在 1000 rpm 条件下离心 3 min，弃去上

清液，加 1-2 mL CM 维持培养基（含 10μM IMC-014-Y）后混匀。然后将所有细胞悬液加入含适量 CM 维持培养基（含 10μM IMC-014-Y）的基质胶包被的六孔板（1 孔）或 35mm 皿

中培养过夜。24h 后，换成不含 IMC-014-Y 的 CM 维持培养基，视培养基颜色或隔 2 天换液。

1、弃去培养基，每孔加入 1mL 心肌细胞消化液（货号 IMI-M001X），置于 37℃培养箱消化 1-2 h。

2、1-2 h 后每孔加入等量 CM 维持培养基（含 10μM IMC-014-Y），轻轻吹打细胞，使细胞解离成单细胞。

3、将细胞悬液收集到 15 mL 离心管中，室温下 300 g 离心 5 min。

4、仔细抽吸上清液，不干扰细胞，用 1mL 恢复室温的 CM 维持培养基重悬细胞（含 10μM IMC-014-Y），轻轻地上下移液以确保细胞溶液均匀。

5、使用 CM 维持培养基（含 10μM IMC-014-Y）稀释细胞，将细胞以 1:1 比例接种到基质胶包被的六孔板或 35mm 皿中培养过夜（按底面积算，1 个 T25 相当于六孔板 2.5 个孔，

六孔板 1 孔可传 12 孔板的 2 孔，24 孔板的 4 孔，96 孔板的 6 孔）。24h 后，换成不含 IMC014-Y 的 CM 维持培养基，视培养基颜色或隔 2 天换液。

心肌细胞进行再接种:如果需要将心肌细胞按合适密度接种到新的培养皿/瓶中，可对心肌细胞进行再接种，再接种操作会导致20%左右的细胞死亡，即损失20%的细胞。

1.室温平衡心肌细胞复苏液、DPBS溶液，37℃预热心肌细胞消化液。

2.取出心肌细胞铺板液包被过的培养皿/瓶，吸去心肌细胞铺板液并加入适量心肌细胞复苏液，置于5%CO 2 的37℃恒温细胞培养箱中。

3.吸除心肌细胞培养基，加入DPBS溶液清洗一次。

4.移除DPBS，加入预热的心肌细胞消化液使之完全覆盖皿/瓶底。

5.37℃孵育3-5分钟，显微镜下观察到大部分细胞相互分离，表明达到理想的消化时间。

6.向皿/瓶中加入消化液3-5倍体积的RPMI1640+10%FBS终止消化，用枪扇形吹打培养皿/瓶底，使皿/瓶底贴附的心肌细胞脱落，将细胞转移至15ml 离心管中，再加入适量中和液冲洗皿/瓶底，收集剩余细胞加入15ml离心管中，300g离心5分钟。

I .小心移除上清，用心肌细胞复苏液重悬细胞，轻柔吹打混匀，并接种到包被过的培养皿/瓶中，十字晃动使细胞均匀分布。

II.5%CO 2 的37℃恒温培养箱中培养24-48小时后，更换为心肌细胞培养基继续培养。

III.心肌细胞需要在二氧化碳培养箱中继续培养2-8天恢复搏动；此期间心肌细胞需要每隔48h换一次心肌细胞培养基。

重要提醒：吹打力度要轻柔，避免损伤细胞。亦可用心肌细胞培养基+10%FBS终止消化。

培养材料准备心肌细胞铺板液包被培养皿/瓶：在4℃冰面上，往培养皿/瓶中添加心肌细胞铺板液至完全覆盖皿/瓶底(建议1ml/六孔板单孔)，37℃包被1小时。如果暂时不用，可用塑封膜封口后2-8℃储存，并于1周内使用，保存期间心肌细胞铺板液需始终保持完全覆盖皿底。

重要提醒：操作时需要将铺板液始终置于冰上；正确操作下铺板液应呈清亮，若操作时间过长或温度过高，铺板液会变得粘稠甚至呈胶状，不宜使用。

心肌细胞复苏(适用于冻存的细胞）

1.将心肌细胞复苏液从4°C冰箱中取出，室温平衡30分钟。

2.打开水浴锅，设定温度为37°C。

3.开启生物安全柜进行紫外灭菌30分种。

4.在冰上将1ml心肌细胞铺板液加入6孔板的一个孔中(0.1ml/cm 2 )，随即前后左右晃动6孔板，使铺板液均匀覆盖孔的表面。

5.将剩余铺板液迅速放回冰箱，将6孔板放入细胞培养箱中孵育1小时。

6.取出孵育好的6孔板，放于生物安全柜中，吸除心肌细胞铺板液后，立刻在孔内加入1ml 心肌细胞复苏液。

7.从高效液氮储存罐中取出需要复苏的细胞，将其放于干冰中暂存。

8.从干冰中取出细胞，迅速将冻存管的下1/2没入水浴锅中，轻柔晃动1-2分钟至管中仅剩一小块冰时，将其取出。

9.75%酒精擦拭冻存管表面后，将其放入生物安全柜中，拧开管盖，用1ml枪尖轻柔的将管中液体尽可能多的转移至15ml离心管中，用1ml心肌细胞复苏液轻柔冲洗冻存管，以5秒钟一滴的速度将冲洗液缓慢滴加入15ml离心管，边滴加边轻柔晃动离心管。

10.再用枪尖以同样速度，滴加1ml心肌细胞复苏液至15ml离心管，边滴加边轻柔晃动离心管。

11.用移液管由慢（2秒钟一滴）到快的滴加9ml心肌细胞复苏液，同时轻柔晃动离心管。300g离心5分钟。

12.在生物安全柜内吸除上清，用2ml移液管取1ml心肌细胞复苏液轻柔吹打细胞沉淀3-5次后，将其加入6孔板中，前后左右十字晃动混匀（可按比例稀释计数）。

13.显微镜下观察，细胞均匀分布。

14.在6孔板上标记好细胞名称、日期以及操作人员后，将其放入细胞培养箱，再次前后左右晃动混匀，放入细胞培养箱种培养24-48小时至绝大多数细胞贴壁后即可换液为心肌细胞培养基。

重要提醒：心肌细胞复苏计数后，可按需求接种至需要的培养容器；

心肌细胞培养时，按照推荐的密度接种，能够抑制成纤维细胞生长速度；

重要提醒：心肌细胞复跳后，建议继续培养1-2天稳定细胞状态。

心肌细胞维持

1.将心肌细胞培养基室温平衡30分钟。

2.将心肌细胞用心肌细胞培养基培养，每48小时换液一次。更换时，贴壁加入培养基避免刮碰细胞；亦可加入标准量150%的心肌细胞培养基，每72小时换液一次。

重要提醒：细胞在6-8周内性状稳定。如果需要长期培养，为了维持细胞稳定性和纯度，需要定 期采用心肌细胞纯化液进行处理,一般每6周处理一次