原理及用途

β-兴奋剂检测试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测尿液、血清、牛奶、组织等样本中的β-兴奋剂(beta-adrenergic,BAA)，试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、辣根酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时，加入标准品或样品溶液，样本中的β-兴奋剂和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗β-兴奋剂抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含β-兴奋剂含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中β-兴奋剂的残留量。

2 技术指标

2.1 试剂盒灵敏度：0.1ppb(ng/ml)

2.2 反应模式：25℃，30min～15min

2.3 检测下限：

尿液、血清、牛奶……………0.3ppb

组织……………………………0.4ppb

饲料、奶粉……………………1ppb

2.4 交叉反应率：

盐酸克伦特罗…………………100%

沙丁胺醇………………………80%

 2.5 样本回收率：

尿样、血清、牛奶……………95%±10%

组织、饲料……………………85%±15%

奶粉……………………………95%±20%

3 β-兴奋剂检测试剂盒组成

酶标板……………………………96孔

标准液：各1ml

0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

高标准液（红盖）：100ppb…………1ml

酶标记物（红盖）……………………5.5ml

抗体工作液（蓝盖）…………………5.5ml

底物液A（白盖）……………………6ml

底物液B（黑盖）……………………6ml

终止液（黄盖）………………………6ml

20×浓缩洗涤液（白盖）……………40ml

10×浓缩复溶液(黄盖)………………50ml

说明书…………………………………1份

盖板膜…………………………………1张

自封袋…………………………………1个

4 需要的器材和试剂

4.1 仪器：酶标仪、打印机、均质器、氮气吹干装置、振荡器、离心机、恒温培养箱、水浴锅、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：单道20µl-200µl、100µl-1000µl，多道300µl

4.3 试剂：甲醇、正己烷、无水硫酸钠

5 样本前处理

5.1 样本处理前须知：

实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。

5.2 配液：

配液1：复溶液

将10×浓缩复溶液用去离子水10倍稀释(1份10×浓缩复溶液加9份去离子水)，用于样本的复溶，复溶液在4℃环境可保存一个月。

配液2：工作洗涤液

    将20×浓缩洗涤液20倍稀释(1份20×浓缩洗涤液加19份去离子水)。

5.3 样本前处理步骤：

5.3.1 尿液、血清、牛奶处理方法：

1）将样本室温4000r/min离心5min，血清和尿液取上层清液0.1ml（牛奶先去除上层脂肪层，再取下层液0.1ml），加入0.2ml复溶液（配液1），混匀后取50ul分析。

样本稀释倍数：3    检测下限：0.3ppb

5.3.2 组织样本处理方法：

1）称取均质后的组织样本1g±0.05g，加入3ml复溶液（配液1），充分振荡2min，室温4000r/min离心10min (若组织样本中油脂含量较高，可在振荡后放入85℃水浴10min后再离心)，取50µl上清液进行分析。

样本稀释倍数：4   检测下限：0.4ppb

5.3.3饲料样本处理方法：

1）称取均质后的饲料样品1g±0.05g，加入10ml甲醇，再加入5g无水硫酸钠，振荡2min，室温 4000r/min离心10min；

2）取上清液1ml于50-60℃下氮气或空气吹干，用1ml复溶液（配液1）溶解干燥的残留物，再加入1ml正己烷，振荡30s，室温4000r/min离心5min。

3）去除上层正己烷，取50µl下层液进行分析。

    样本稀释倍数：10    检测下限：1ppb

5.3.4奶粉样本处理方法：

1）称取均质后的奶粉样品1g±0.05g，加入5ml复溶液（配液1），振荡至完全溶解，室温 4000r/min离心5min；

2）去除上层脂肪层，取下层液0.1ml，加入0.1ml复溶液（配液1），混匀后取50ul分析。

样本稀释倍数：10    检测下限：1ppb

6 酶联免疫试验步骤

    将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

6.1 编    号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

6.2 加样反应：加标准品或样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶标记物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗体工作液，用盖板膜封板，轻轻振荡5秒混匀，25℃反应30min。

6.3 洗    涤：小心揭开盖板膜，甩去孔内液体，每孔加350ul工作洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，最后一次拍干（用吸水纸拍干，拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6.4 显    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光显色15min。

6.5 终    止：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，终止反应。

6.6 测吸光值：用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值（建议用双波长450/630nm）。测定应在终止反应后10min内完成。

7 结果分析

7.1 百分吸光率的计算

    标准液或样本的百分吸光率等于标准液或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb标准溶液的平均吸光度值

7.2 标准曲线的绘制与计算

    以标准液百分吸光率为纵坐标，对应的标准液浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准液的半对数曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。

    若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）

8 β-兴奋剂检测试剂盒注意事项

8.1 室温低于25℃或试剂及样本没有回到室温（25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

8.2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

8.3 混合要均匀，洗板要彻底，在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育过程中，用盖板膜封住微孔板，避免光线照射。

8.5 不要使用过了有效期的试剂盒，不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

8.6 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8.7 反应终止液有腐蚀性，避免接触皮肤。

9 贮藏及保存期

储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，避免冷冻。

保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。