注意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

规格:100T/48S

产品内容：

提取液：液体 50mL×1 瓶，-20℃保存； 试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃保存； 试剂二：液体 0.6mL×1 支，-20℃保存； 试剂三：液体 40mL×1 瓶，4℃保存；

试剂四：粉剂×2 支，4℃保存，临用前加入 1mL 双蒸水，用不完的试剂仍 4℃保存；

试剂五：粉剂×2 支，-20℃保存，临用前加入 500µL 双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存； 试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存，临用前加入 1.5mL 双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存；

产品说明：

CS（EC 2.3.3.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，是三羧酸循环第一个限速酶，是三羧酸循环主要调控位点之一。

CS 催化乙酰 CoA 和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶 A，进一步水解产生柠檬酸；该反应促使无色的DTNB 转变成黄色的 TNB，在 412nm 处有特征吸光值。

试验中所需的仪器和试剂：

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本前处理

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 提取液和 10µL 试剂二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

将匀浆液 600g，4℃离心 5min。

将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 CS。

在沉淀中加入 200µL 试剂一和 2µL 试剂二，反复吹打充分混匀，用于 CS 测定。柠檬酸合酶酶活即沉淀和上清液中的酶活之和。

二、测定步骤：

1、分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 412nm，蒸馏水调零。

2、试剂三置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）水浴中预热 10min 左右（保证无沉淀）。

3、操作表：

在微量玻璃比色皿/96 孔板中分别加入

加试剂六的同时开始计时，记录 412nm 波长下 10 秒时的初始吸光度 A1，之后迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴中准确反应 2 分钟（96 孔板放入恒温箱中）；迅速取出比色皿并擦干，412 nm 下记录 2 分 10 秒时的吸光度 A2，上清液、沉淀的测定管、对照管均需测量(每个样本需测 4 管)。

计算上清液的测定管∆A1=A2-A1，上清液对照管的∆A1’=A2-A1，沉淀的测定管∆A2=A2-A1， 沉淀的对照管∆A2’=A2-A1，计算∆A 上清=∆A1-∆A1’，计算∆A 沉淀=∆A2-∆A2’。

三、CS 活性计算：

1、按微量玻璃比色皿计算:

（1） 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：37℃或 25℃下每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

CS 上清（U/mg prot）=∆A 上清÷（ε×d）×V 反总÷（Cpr 上清×V 样本）÷T

=1050×∆A 上清÷Cpr 上清

CS 沉淀（U/mg prot）=∆A 沉淀÷（ε×d）×V 反总÷（Cpr 沉淀×V 样本）÷T

=1050×∆A 沉淀÷Cpr 沉淀

CS（U/mg prot）=CS 上清+CS 沉淀=1050×∆A 上清÷Cpr 上清+1050×∆A 沉淀÷Cpr 沉淀。

（2） 按样本鲜重计算：

单位的定义：37℃或 25℃下每 g 组织在反应体系中每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

CS 上清（U/g 鲜重）=∆A 上清÷（ε×d）×V 反总÷（W×V 样本÷V 提取）÷T =1061×∆A 上清÷W CS 沉淀（U/g 鲜重）=∆A 沉淀÷（ε×d）×V 反总÷（W×V 样本÷V 沉淀）÷T =212×∆A 沉淀÷W CS（U/g 鲜重）=CS 上清+CS 沉淀=1061×∆A 上清÷W+212×∆A 上清÷W。

（3） 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：37℃或 25℃下每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

CS 上清（U/104 cell）=∆A 上清÷（ε×d）×V 反总÷（500×V 样本÷V 提取）÷T=2.1×∆A 上清CS 沉淀（U/104 cell）=∆A 沉淀÷（ε×d）×V 反总÷（500×V 样本÷V 沉淀）÷T =0.42×∆A 沉淀CS（U/104 cell）=CS 上清+CS 沉淀=2.1×∆A 上清+0.42×∆A 沉淀。

ε：TNB 的消光系数，13.6×10-3mL/(nmol·cm)；V 反总：反应体系总体积，0.2 mL；d：比色皿光径，1cm；V 样本：加入的样本体积，0.007mL；V 提取：提取液体积，1.01mL；V 沉淀：溶解沉淀的总体积，0.202mL；T：反应时间，2min；Cpr 上清：上清液的蛋白浓度，mg/mL；Cpr 沉淀：

 沉淀溶解后的蛋白浓度, mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细胞数量/细菌，500 万。

3、按 96 孔板计算：将上述公式中的 d=1cm 改为 d=0.6cm（96 孔板光径）进行计算即可。

注意事项：

1、测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。

2、比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水， 将此烧杯放入 37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

4、用 96 孔板测定时，根据测定管数量配制测定管工作液（试剂三、四、五、六）和对照管工作液

（试剂三、四），因通过单位时间内吸光值变化计算酶活，不推荐同时测多个样本。