人＆各种动物血管内皮细胞分离液实验方法

【包装规格】

2×200ml/Kit

【产品组成】

为方便广大用户使用，试剂内容如下：

【实验前准备】

1.    适用仪器

最大离心力可达 1200g 的水平转子离心机。

（离心机使用时调整为慢升慢降（具体参数请咨询离心机厂家）建议升速（指开始启动→达 到设定离心力）的时间、降速（指设定离心时间完成→机器完全停止）时间均控制在 3 分钟 左右。）

2.    实验最佳分离时间

为获得最佳的实验结果，最好在取样 2h 内进行实验，样品存放时间越长，细胞分离效 果越差。样品放置超过 6h 后分离效果更差甚至不能达到分离目的。

3.    分离液的使用环境

a.  分离液需常温（15℃-25℃) 避光保存，严禁冷藏冷冻保存；

b.  使用时严格遵守无菌操作规范（超净工作台或生物安全柜内），并在 20℃-25℃环境温 度下进行操作，20℃条件下分离效果最佳。超出此温度范围，有可能使分离液密度发生 改变，造成分离效果不佳。

4.    无菌离心管

5.    参考值（目的细胞参考范围）

本试剂盒可保证目的细胞的提取率大于 80% ，不是纯度。如需获得高纯度目的细胞， 请配合免疫磁珠分选。本试剂盒可减少磁珠的使用量，减少成本。

【检验方法】

全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃（试剂需要复温。夏季 20℃ , 冬季 25℃ 。）的条件下进行。

【血管内皮组织单细胞悬液的制备】

1.  取组织块称重后，用眼科剪刀无菌操作，将血管内皮组织剪成小块。

2.  将组织块放在 70µm 细胞筛网(产品编号：TBDTM-SC ，需要另购)上，用研磨器反复揉 搓，边揉搓边加入匀浆冲洗液 (以 0. 1g 组织为例，约加 5-8ml) ，使细胞全部通过筛网 冲到离心管中。

注：需要让细胞形成单个的细胞悬液冲到离心管中，而不是被揉搓研磨挤压到离心管中。

目的：使血管内皮组织形成单个的细胞，而不是成团或碎片组织。单个的细胞更易分离。

3.  弃去筛网，组织研磨液经 300-400g ，离心 10min ，弃去上清。

4.  用组织样本稀释液重悬组织细胞，将细胞悬液细胞浓度调整为 2×108-- 1×109/ml (以 0. 1g 组织为例，约使用 0.5- 1ml 组织样本稀释液重悬细胞) ，备用。

注：A.  多个动物血管内皮组织需要分离时，应逐个单独进行，不可同时混合进行揉搓研磨。 B.  若发现匀浆冲洗液冲洗的细胞粘度较大，可进行以下处理：

①配置新冲洗液：4 份的匀浆冲洗液加 1 份的胰蛋白酶/EDTA 消化液（ 需自备或另购）进行稀释，配置为新冲洗液。

②离心管预处理：再研磨开始之前，在离心管中加入 0.5-1ml 胎牛血清，进行保护

和终止胰蛋白酶/EDTA 消化液。

③再进行 2,3,4 实验步骤即可。

根据血管内皮组织样本单细胞悬液的量，分以下两种情况：

情况 A：样本细胞悬液量 0.5-1.5ml 时，实验方法如下：

1.    取一支 5ml 无菌玻璃离心管（货号：TUB2016），先加入 2ml 分离液 1，后缓慢加入 1ml 的分离液 2 ，形成梯度界面。再缓慢加入 0.5- 1.0ml 样本细胞悬液。样本细胞悬液小心 加于分离液液界面之上，各液面

分层一定要清晰。（分离液总量不得少于 2ml ，样本细 胞悬液不得少于 0.5ml）或（取一支 10ml 无菌硅化离心管，先加入 3ml 分离液 1 ，后缓慢加入 1.5ml  的分离液 2 ，形成梯度界面。再缓

慢加入 0.5- 1.5m 样本细胞悬液。样本细胞悬液 小心加于分离液液界面之上。（分离液总量不得少于 4ml，样本细胞悬液不得少于 0.5ml)

2.    以 450g   ，离心 30min 。（注：如改变样本细胞悬液及分离液用量，需相应调整离心力  及离心时间；如使用 5ml 无菌玻璃离心管，可能需要使用 50ml 的 PBMC 高效离心管。）

3.    离心后，此时离心管中由上至下分为六层。第一层为组织稀释液层。第二层为环状乳白 色内皮细胞层 (第一层白环及上层 50%分离液 2)。第三层为环状乳白色单个核细胞层(下 层 50%分离液 2 及第二层白环) 。第四层为透明分离液 1 液层。第五层为粒细胞层。第 六层为红细胞和组织细胞碎片层。

4.    ①小心吸取组织稀释液层转移到新离心管 A 中。

②小心吸取离心管中的环状乳白色内皮细胞层转移到新离心管 B 中。

③小心吸取离心管中的环状乳白色单个核细胞层转移到新离心管 C 中。

5.    向含有内皮细胞的离心管 B 中，加入 5- 10ml 洗涤液，混匀细 胞。

6.    400g ，离心 10min 。弃去上清。

7.    用吸管吸取 5ml 清洗液重悬所得细胞。

8.    250g ，离心 10min ，弃去上清。

9.    重复清洗两次，弃去上清，用 0.5ml 清洗液或根据下一步实 验要求加入相对应液体，重悬所得细胞。

分离图例

情况 B：样本细胞悬液量 2.0-3.0ml 时，实验方法如下：

1.     取一支 15ml 无菌离心管，先加入 5ml 分离液 1 ，后缓慢加入 2ml 分离液 2 ，形成梯度 界面，再缓慢吸取 2-3ml 样本细胞悬液加于分离液液面之上。各液面分层一定要清晰。

（总液体量不得超过 2/3）。

2.     以 600g  ，离心 30min。

3.     离心后，此时离心管中由上至下分为六层。第一层为组织稀释液层。第二层为环状乳白 色内皮细胞层 (第一层白环及上层 50%分离液 2) 。第三层为环状乳白色单个核细胞层 (下层 50%分离液 2 及第二层白

环) 。第四层为透明分离液 1 液层。第五层为粒细胞层。 第六层为红细胞和组织细胞碎片层。

4.     ①小心吸取组织稀释液层转移到新离心管 A 中。

②小心吸取离心管中的环状乳白色内皮细胞层转移到新离心管 B 中。

③小心吸取离心管中的环状乳白色单个核细胞层转移到新离心管 C 中。

5.     向含有内皮细胞的离心管 B 中，加入 5- 10ml 洗涤液，混匀 细胞。

6.     400g ，离心 10min 。弃去上清。

7.     用吸管吸取 5ml 清洗液重悬所得细胞。

8.     250g ，离心 10min ，弃去上清。

9.     重复清洗两次，弃去上清，用 0.5ml 清洗液或根据下一步实 验要求加入相对应液体，重悬所得细胞。

分离图例

【分离过程中可能出现的情况及处理方案】

情况一：内皮细胞层和单个核细胞层混在一起不能分开

1.     吸取全部白色环状细胞层，清洗后用组织样本稀释液 1-2ml 重悬细胞。

2.     使用分离液 2 重新提取内皮细胞。

3.     取 15ml 离心管，加入 4ml 分离液 2 ，将用组织样本稀释液重悬的 1-2ml 细胞缓慢加于 分离液之液面上，400g ，离心 20min。

4.     离心后，离心管可分为 4 层，第一层组织稀释液层，第二层内皮细胞层，第三层分离液 层，第四层单个核细胞层。

5.  可重复检验方法中的目的细胞洗涤方法，获得内皮细胞。

【注意事项】

1.  全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃的条件下进行。为获得最佳的实验结果， 最好在取样 2h 内进行实验，样本存放时间越长，细胞分离效果越差。样本放置超过 6h 后分离效果更差甚至不能达到分离目的。

2.  本实验最好不使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心 管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会 变成毛面，影响细胞分离效果。

【储存条件及有效期】

常温保存，有效期 2 年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启 封后置常温保存。如 4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。

【参考值（参考范围）】

本实验内皮细胞提取率大于 80%。

【可能存在的问题及解决方法】

1.    由于血液粘度、细胞密度等差异可能造成的问题及解决方案如下表所示：

2.    离心力公式

3.    本分离液分离细胞的原理为密度梯度离心，其密度与温度、大气压等密切相关。不同地 区客户可根据当地情况对离心条件进行适当调整。建议对离心条件进行调整时，恒定离 心时间，对离心转速进行调整。

4.    本分离液依照国际标准，全部使用药用级原料，性能指标与国产同类产品略有不同，可 能出现红细胞沉降不完全的情况，可以适当加大离心转速。

注：在对离心条件进行调整时，离心转速的加减以 50- 100g 为基数，直至达到最佳分离效果， 离心力最小不得小于 400g ，最大不得大于 1200g 。离心时间以 20-30min 为准。