产品介绍:
本产品为在 PAGE 凝胶或蛋白免疫印记硝酸纤维素膜上检测糖蛋白的试剂盒。它有如下特点:
1. 一站式,,用户不要单独配制所需成分,简单快捷。
2. 提供一种阳性对照蛋白及一种阴性对照蛋白,便于分析问题。
3. 专一性强,通过共价修饰方式检测糖基,不检测蛋白部分。
4. 快捷,只需不到两小时,而其他的染色方法需要四到五小时。
5. 染色后的糖蛋白为品红色条带,背景为浅粉色或者无色
6. 灵敏度高,理论上可以达到微克级别,但实际应用时灵敏度跟靶蛋白的糖基化程度相关。
7. 可以用于 SDS-PAGE 和 2D 电泳的凝胶检测,也可以用于琼脂糖凝胶电泳的检测(但背景较高),还可以用于硝酸纤维素印迹膜的检测。
8. 本产品足够染色 10 张 mini-PAGE 胶或 20 张 8×8cm 的蛋白印迹纤维素膜。
运输及保存 :常温运输和保存,但阳性对照和阴性对照干粉需要 4℃或更低温度长期保存,
有效期:一年,但糖蛋白染色试剂的有效期只有半年(从出厂时间开始计算)
实验前准备
1. 配制 3%醋酸溶液:将 30 mL 自备的冰醋酸与 970 mL 超纯水混匀,室温保存备用。
2. 配制 50%甲醇溶液:将 250 mL 自备的甲醇与 250 mL 超纯水混匀,室温保存备用。
3. 配制氧化试剂溶液:将本试剂盒提供的氧化试剂干粉转移到本试剂盒提供的 250mL 空本色塑料瓶中,然后加入 250 mL 的 3%醋酸溶液(第 1 步配制),充分混匀溶解后得到氧化试剂溶液,室温保存备用。
4. 配制还原试剂溶液:将本试剂盒提供的还原试剂干粉转移到本试剂盒提供的 250mL 空本色塑料瓶中,然后加入 250 mL 的超纯水,充分混匀溶解后得到还原试剂溶液,室温保存备用。
5. 配制阳性对照(辣根过氧化物酶)溶液:向装有 1 mg 辣根过氧化物酶固体的棕色管中加入 1 mL 1×SDS-PAGE 上样缓冲液(自备),所得辣根过氧化物酶溶液的浓度为 1mg/mL,然后分装成 100uL/管共 10 管,留下一管当天使用,其余的放-20℃长期保存。对于 80 mm×80 mm 的凝胶来说,每条泳道加 10 μL 的阳性对照溶液即可。
6. 配制阴性对照(大豆胰蛋白酶抑制剂)溶液:向装有 1 mg 大豆胰蛋白酶抑制剂干粉的管中加入 1×SDS-PAGE 上样缓冲液(自备),所得大豆胰蛋白酶抑制剂溶液的浓度为 1 mg/mL,然后分装成 100uL/管共 10管,留下一管当天使用,其余的放-20℃长期保存。对于 80 mm×80 mm的凝胶来说,每个泳道加 10 μL 的阴性对照溶液即可。
7. 样品稀释:用 SDS-PAGE 上样缓冲液将蛋白样品浓度稀释为 1mg/mL,SDS-PAGE 上样缓冲液终浓度为 1×。对于 80 mm×80 mm 的凝胶来说,每个泳道加 10μL 的样品。
凝胶染色的操作步骤(注意:请在通风橱中进行以下操作)
8. 取出电泳后的 SDS-PAGE 凝胶,加入到装有 100mL 50%甲醇溶液的器皿中,完全浸泡 30 分钟后,倒出甲醇溶液。
9. 用 100mL 3%醋酸溶液洗涤胶块两次,每次轻轻振荡 10 分钟。
10. 将 PAGE 胶块转移到装有 25mL 氧化试剂的器皿中,轻轻振荡 15 分钟。
11. 用 100mL 3%醋酸溶液洗涤胶块 3 次,每次轻轻振荡 5 分钟。
12. 将胶块转移到装有 25mL 糖蛋白染色试剂的器皿中,轻轻振荡 15 分钟。(注:若染色试剂中有晶体析出,只需取上清液即可,不要加热溶解晶体。)
13. 将胶块转移到装有 25mL 还原试剂的器皿中,轻轻振荡 5 分钟。
14. 用 3%醋酸溶液洗涤胶块,然后用超纯水洗涤至显色,糖蛋白将显现为品红条带。胶块保存在 3%醋酸溶液中。
硝化纤维素膜染色的操作步骤(注意:请在通风橱中进行以下操作)
1. 用 20mL 3%醋酸溶液洗涤膜两次,每次轻轻振荡 10 分钟。2. 将膜转移到 10mL 的氧化试剂中,轻轻振荡 15 分钟。
3. 用 10mL 3%醋酸溶液洗涤膜 3 次,每次轻轻振荡 5 分钟。
4. 将膜转移到 10mL 的糖蛋白染色试剂中,轻轻振荡 15 分钟。(注:若染色试剂中有晶体析出,只需离心取上清液去除晶体即可,不要加热来溶解晶体。)
5. 将膜转移到 10 mL 还原试剂中,轻轻振荡 5 分钟。
6. 用 3%醋酸溶液洗涤膜,然后用超纯水洗涤至显色,糖蛋白将显现为品红条带。膜可保存在 3%醋酸溶液中。
7. 检测后如果没有条带,可以用转膜后的 PAGE 胶进行检测,因为糖蛋白(尤其是高度糖基化的蛋白)转膜效果比较差。