4.     目的细胞最佳分离时间

血液离体后 2 小时内。如达不到 2 小时内分血条件，请务必于 4 小时内进行分血步骤， 超过 4 小时很难顺利进行分离。

5.    分离液的使用环境

a.  分离液需常温（15℃-25℃) 避光保存，严禁冷藏冷冻保存；

b.  使用时严格遵守无菌操作规范（超净工作台或生物安全柜内），并在 18℃-22℃环境温 度下进行操作，20℃条件下分离效果最佳。超出此温度范围，有可能使分离液密度发生 改变，造成分离效果不佳。

6.    参考值（目的细胞参考范围）

本试剂盒可保证目的细胞的提取率大于 80% ，不是纯度。如需获得高纯度目的细胞， 请配合免疫磁珠分选。本试剂盒可减少磁珠的使用量，减少成本。

【检验方法】

全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃（试剂需要复温。夏季 20℃ , 冬季 23℃ 。）的条件下进行。

实验方法：方法一如下（不需血浆留存备用）：

1. 取一支 15ml 无菌离心管，先加入 5ml 分离液 1 ，后缓慢加入 2ml 分离液 2 ，形成梯度 界面，再缓慢吸取 2-3ml 新鲜抗凝血加于分离液液面之上。各液面分层一定要清晰。或 取一支 50ml 无菌离心管，先加入 15ml 分离液 1 ，后缓慢加入 5ml 分离液 2 ，再缓慢吸 取 5- 15ml 新鲜抗凝血加于分离液液面之上。各液面分层一定要清晰。（分离液试剂总 量不得少于 4ml ，新鲜抗凝血不得少于 2ml 。总液体量不得超过 2/3）。

2. 以 500g 或 600g ，离心 30min（注：如改变血液样本及分离液用量，需相应调整离心力 及离心时间。）

3. 离心后，离心管中由上至下分为六层。第一层为血浆层。第二层环状乳白色为（人及各 种动物）树突状细胞层(第一层白环及上层 50%分离液 2）。第三层环状乳白色为单个核 细胞层(下层50%分离液 2 及第二层白环)。第四层为透明分离液 1 液层。第五层为粒细 胞层。第六层为红细胞层。

4. ①小心吸取血浆层转移到新离心管 A 中备用（分离效果不理想，可进行后续处理方案）。 ②小心吸取离心管中的（人及各种动物）树突状细胞层转移到新离心管 B 中。

③小心吸取离心管中的单个核细胞层转移到新离心管 C 中。

5. 向含有（人及各种动物）树突状细胞层离心管 B 中，加入 5- 10ml 清洗液，混匀细胞。

6. 250g ，离心 10min 。弃去上清。

7. 用吸管吸取 5ml 清洗液重悬所得细胞。

8. 250g ，离心 10min ，弃去上清。

9. 重复清洗两次，弃去上清，用 0.5ml 清洗液或根据下一步实 验要求加入相对应液体，重悬所得细胞。

实验方法：方法二如下（需留取血浆备用）：

1.  首先取抗凝血，250g ，离心 10min ，抽取血浆留存备用。补加胎牛血清(添加量与留存血 浆量等同)  制成细胞悬液，根据细胞悬液液体体积，选择适当离心管进行试验。

2.  取一支 15ml 无菌离心管，先加入 5ml 分离液 1 ，后缓慢加入 2ml 分离液 2 ，形成梯度界 面，再缓慢吸取 2-3ml 细胞悬液血加于分离液液面之上。各液面分层一定要清晰。或取一 支 50ml 无菌离心管，先加入 15ml 分离液 1，后缓慢加入 5ml 分离液 2，再缓慢吸取 5- 15ml 细胞悬液血加于分离液液面之上。各液面分层一定要清晰。（分离液试剂总量不得少于 4ml ，细胞悬液不得少于 2ml 。总液体量不得超过 2/3）。

3.  以 500g 或 600g ，离心 30min 。（注：如改变血液样本及分离液用量，需相应调整离心力 及离心时间。）

4.  离心后，离心管中由上至下分为六层。第一层为稀释液层。第二层环状乳白色为（人及 各种动物）树突状细胞层(第一层白环及上层 50%分离液 2）。第三层环状乳白色为单个核 细胞层(下层 50%分离液 2 及第二层白环)。第四层为透明分离液 1 液层。第五层为粒细胞 层。第六层为红细胞层。

5.  ①小心吸取稀释液层转移到新离心管 A 中备用（分离效果不理想，可进行后续处理方案）。 ②小心吸取离心管中的（人及各种动物）树突状细胞层转移到新离心管 B 中。

③小心吸取离心管中的单个核细胞层转移到新离心管 C 中。

6.  向含有（人及各种动物）树突状细胞层离心管 B 中，加入 10ml 清洗液（产品编号： 2010X1118），混匀细胞。

7.  250g ，离心 10min 。弃去上清。

8.  用吸管吸取 5ml 清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。

9.  250g ，离心 10min ，弃去上清。

10.  重复清洗两次，弃去上清，用 0.5ml 清洗液（产品编号：2010X1118）或根据下一步实 验要求加入相对应液体，重悬所得细胞。

分离图

【分离过程中可能出现的情况及处理方案】

情况一：树突状细胞层和单个核细胞层混在一起不能分开

1.     吸取全部白色环状细胞层，清洗后用备用的血浆 1-2ml 重悬细胞。

2.     使用分离液 2 重新提取树突状细胞。

3.     取 15ml 离心管，加入 4ml 分离液 2 ，将用血浆重悬的 1-2ml 细胞缓慢加于分离液之液 面上，400g ，离心 20min。

4.     离心后，离心管可分为 4 层，第一层血浆层，第二层树突状细胞层，第三层分离液层， 第四层单个核细胞层。

5.     可重复检验方法中的目的细胞洗涤方法，获得树突状细胞

【注意事项】

1.  全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃（夏季 20℃ , 冬季 22-25℃) 的条件下进  行。为获得最佳的实验结果，最好在取血 2h 内进行实验，血液存放时间越长，细胞分离 效果越差。血液放置超过 6h 后分离效果更差甚至不能达到分离目的。

2.  本实验最好不使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心 管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会 变成毛面，影响细胞分离效果。

3.  分离液用量大于血液样本时，分离效果更佳。

4.  吸取过多的目的细胞层上层溶液会导致血浆蛋白及血小板混杂。

5.  如实验后细胞得率或活性过低，请联系 技术支持以寻求帮助，具体联系方式 详见下方生产企业信息。

【储存条件及有效期】

常温保存，有效期 2 年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启 封后置常温保存。如 4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。

【参考值（参考范围）】

本实验树突状细胞提取率大于 80%。

下表为成年人外周血中各种细胞的数量及比例，用户可适当进行参考。

【可能存在的问题及解决方法】

1.    由于血液粘度、细胞密度等差异可能造成的问题及解决方案如下表所示：

2.    离心力公

3.    本分离液分离细胞的原理为密度梯度离心，其密度与温度、大气压等密切相关。不同地 区客户可根据当地情况对离心条件进行适当调整。建议对离心条件进行调整时，恒定离 心时间，对离心转速进行调整。

4.    本分离液依照国际标准，全部使用药用级原料，性能指标与国产同类产品略有不同，可 能出现红细胞沉降不完全的情况，可以适当加大离心转速。

注：在对离心条件进行调整时，离心转速的加减以 50- 100g 为基数，直至达到最佳分离效果， 离心力最小不得小于 400g ，最大不得大于 1200g 。离心时间以 20-30min 为准。