1. 预期用途

本试剂盒用于检测血清、血浆等样本中的浓度，仅供研究使用。

2. 检测原理 

试剂盒采用双抗体夹心法原理：将捕获抗体包被于酶标板上，捕获样品及校准品中待测物，加入辣根过氧化物酶标记的酶标二抗，结合形成“抗体-抗原-抗体-HRP”免疫复合物，加入TMB显色后，若样本中有待测物则显蓝色，加入终止液停止反应。检测过程中游离的成分均被洗去，用酶标仪在450 nm处测OD值，颜色的深浅和样品中的待测物含量呈正比，通过绘制标准曲线计算出样本中待测物的浓度。

3. 包含的实验材料实验材料

如需单独采购通用型组分，请提供对应的组分名称。

4. 需要但未包含的实验材料

· 蒸馏水或去离子水，一次性离心管、一次性手套等耗材；

· 移液器、多通道移液器及配套枪头；

· 烧杯、量筒、试剂瓶等容器具；

· 用于封贴微孔板的封板膜或其他替代材料；

· 微孔板振荡器（如有需要）、离心机、旋涡振荡器等辅助设备；

· 恒温培养箱、恒温水浴箱、酶标仪、洗板机。

5. 试剂的准备及储存

· 1×洗液的配制：浓缩洗液（20×）如有晶体析出，需在37℃下加热至晶体全部溶解后使用。用蒸馏水1:20稀释，例如：10mL浓缩洗涤液加入190mL的蒸馏水，混合均匀。

1×通用稀释液的配制：用蒸馏水1:20稀释，例如：10mL的20×浓缩通用稀释液加入190mL的蒸馏水，混合均匀。

1×酶标抗体工作液的配制：100×酶标抗体用“1×通用稀释液”按1:100倍稀释，例如：10uL的（100×）酶标抗体加入990uL的“1×通用稀释液”，混合均匀。配制好的1×酶标抗体工作液可以在2~8℃保存8h。

· 工作校准品的配制：校准品开封前应离心30秒，确保所有校准品集中于底部；

准备7个离心管，将10×校准品按需吸取一定量用“1×通用稀释液”稀释10倍配制成校准品S1。例：50uL的10×校准品+450uL的“1×通用稀释液”，制备得到500μL的S1浓度校准品。在随后的6个离心管中分别加入250μL的“1×通用稀释液”，在这6个试管中（S2~S7）将S1校准品依次倍比稀释6个梯度至S7，共配制7个浓度的校准品，依次为：S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7，如下图所示，“1×通用稀释液”作为零浓度校准品S0，共8支校准品。

6. 样品采集、预处理及储存

· 血清：使用血清采集管采集全血，室温静置待血细胞凝集后取的血清，或直接在1000×g下离心15分钟取得血清。操作应柔和，避免溶血发生。获取的血清应及时进行检测，如不能及时进行检测，应等分为多份，储存在-20℃及以下温度条件，储存时间不超过6个月，样品冻融不超过2次。

· 血浆：使用EDTA或肝素采血管收集血浆。全血采集后以1000×g离心15分钟取得血浆。操作应柔和，避免溶血发生。获取的血浆应及时进行检测，如不能及时进行检测，应等分为多份，储存在-20℃及以下温度条件，储存时间不超过6个月，样品冻融不超过2次。

· 组织：组织称重后剪碎，将剪碎的组织加入裂解液，一般按1:4-1:9的重量体积比，比如100mg的组织样品对应400uL的裂解液，具体可根据实验需要适当调整，最后将匀浆液于5000×g离心5-10分钟，取上清检测。

· 细胞：取适量细胞，于冰上进行超声破碎，5000×g离心5-10分钟，取上清检测。

· 细胞上清：取细胞上清于5000×g离心5-10分钟，取上清检测。

7. 实验步骤

使用前将所有试剂置于室温平衡30分钟左右，也可置于37℃温箱快速回温至室温。

注意：酶标板未恢复室温前，请勿开封。

* 样品稀释液50uL，加样品50uL样品稀释倍数为2倍。

* 样品稀释液80uL，加样品20uL，则稀释倍数为5倍。

* 如样本珍贵量少，可适当加大稀释倍数，应当进行预实验确定最佳稀释倍数。

8. 结果计算

双波长检测结果无需进行调0，可直接进行标曲拟合及结果计算。

以下曲线拟合方式均可使用，选择拟合后r值最佳的拟合方式进行结果计算。

l 四参数逻辑（4-P）曲线拟合：以浓度值为横坐标，吸光度值为纵坐标；

l 多项式曲线拟合：2次多项式、3次多项式；

l 双对数直线拟合：以浓度值取对数，吸光度值取对数后，进行直线拟合；

l 点对点拟合：各相邻点之间分别单独进行线性拟合，分段计算；

推荐使用专业化软件进行结果拟合和计算，如ELISACALC、SPSS、Graphpad Prism等。

**最终样本浓度应乘上样本的稀释倍数。

曲线拟合方式示例图，以下数据和曲线仅供示例，与本试剂盒测定结果无关。

9. 检测的局限性

样本浓度超出检测范围上限时，应当进行适当加大稀释倍数后再次检测，计算结果应当乘上稀释倍数。样本浓度低于LOQ定量限时，检测结果无法进行准确定量。

10. 产品性能指标

以下结果基于校准品的浓度值实验得出，未纳入基质效应等其他因素的潜在影响。

灵敏度：1.66 µg/L

精密度：板内精密度CV＜10%（N=20），板间精密度CV＜15%（N=20）。

特异性（Analytical specificity）：其他相关因子在稀释缓冲液中制备为10μg/mL测定，没有观察到明显的交叉反应。 

11. 注意事项

· 试剂盒内所有成分仅供研究使用！

· 终止液含稀硫酸，具有腐蚀性，应谨慎操作。

· 试剂盒成分含防腐剂、蛋白成分等，可能引起皮肤过敏反应，应佩带口罩避免吸入薄雾。

· 显色剂、浓缩洗液可能引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激，应佩带口罩避免吸入薄雾。

· 佩戴防护手套、防护服、眼睛和面部防护用品，实验操作后彻底洗手。

12. 技术要点

· 不同批次的试剂盒不能混用，不建议将不同板上的微孔板条组装在一块板上检测，尽管是同一批次试剂，也可能存在板与板之间的差异。

· 每次实验时应当始终配制标准曲线平行检测，不能将上一次的标准曲线用于下一次实验结果的计算。

· 不要使用超过有效期的试剂盒进行检测。

· 底物显色剂应当为无色，如变蓝表明已变质，不能应用于实验。

· 使用适当的封板膜密封微孔板条，以便检测结果更加可靠。

· 操作时尽量避免产生气泡。不要将不同试剂瓶的瓶盖交叉使用。

· 应当遵循说明书的操作进行实验，不按照说明书的操作将导致实验结果的变化，任何不遵循说明书的实验操作应当事先询问售后技术支持的建议。否则我们不保证实验结果的可靠。