| (1). KpnI/HindIII酶切pCold-sumo-M vector获得线性化载体，插入与载体有25nt同源臂的引物扩增Gp32基因（966bp），然后应用2xGiboson Assembly Mix连接线性化载体和Gp32，室温孵育15min，然后取5μl连接产物转化DH5a感受态细胞，涂板过夜后菌检。其中左图为长斑情况对比，A为对照（不加片段）B为实验组（Gp32片段），右图为挑取32个斑进行PCR扩增后电泳，其中阳性检出率为31/32(~97%)。 |
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| (2).PCR 扩增pCold-sumo-M vector获得线性化载体，插入与载体有15nt同源臂的引物扩增Bsu基因（1.4kb），然后应用2xGiboson Assembly Mix连接线性化载体和Bst，室温孵育30min，然后取5μl连接产物转化DH5a感受态细胞，涂板过夜后菌检。其中左图为长斑情况对比，A为对照（不加片段）B为实验组（Bsu片段），右图为挑取40个斑进行PCR扩增后电泳，其中阳性检出率为40/40(~100%)。 |
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| (3).以单片段连接为例，载体与片段不同摩尔比对连接效率的影响。载体2742bp，片段2439bp，使用载体与片段摩尔比分别为2:1;1:1;1:2;1:3;1:4;1:5 室温连接30min；片段5’和3’端与载体同源序列大小都为17bp，使用通用引物菌检，阳性条带应为2598bp。 结果表明：载体与连接片段选用不同摩尔比对于菌斑数和菌检阳性率的影响较大，综合推荐摩尔比1:5。图中1-6代表载体与片段摩尔比分别为2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5。 |
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| (4).以单片段连接为例，不同的载体量对连接效率的影响。载体2742bp，片段2439bp，使用载体与片段摩尔比为1:5，载体用量分别为0.001pmol、0.005pmol、0.01pmol和0.015pmol室温连接30min；片段5’和3’端与载体同源序列大小都为17bp，使用通用引物菌检，阳性条带应为2598bp。 结果表明：载体用量在0.01~0.015pmol之间，菌斑数和菌检阳性率较高。图中1-4分别代表载体用量为0.001pmol、0.005pmol、0.01pmol和0.015pmol。 |
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(5).多片段连接
单片段连接：载体长2742bp，片段1长2439bp，使用载体与片段摩尔比为1:5，载体用0.01pmol，室温连接30min，片段5’和3’端与载体同源序列大小都为17bp，使用通用引物菌检，阳性条带应为2598bp。
双片段连接：片段2长654bp， 片段3长1802bp，载体长2742bp，载体与片段摩尔比为1:5（片段2和3皆为0.05pmol），载体用0.01pmol，室温连接30min，各片段之间的同源序列长度皆为17bp，通用引物菌检阳性条带为2598bp。
三片段连接：片段2长654bp， 片段4长822bp，片段5长997bp，载体长2742bp，载体与片段摩尔比为1:5（片段2、4和5皆为0.05pmol），载体用0.01pmol，室温连接30min，各片段之间的同源序列长度皆为17bp，通用引物菌检阳性条带为2598bp。
图中1-3分别为单片段、双片段和三片段连接，A-E为PCR扩增连接所需片段，分别为片段2：654bp，片段1：2439bp，片段3：1802bp，片段5：997bp，片段4：822bp， 结果表明：单片段连接的效率显著高于双片段和三片段连接，在进行双片段和三片段连接时，阳性菌检率在50%左右，可多挑取菌斑进行菌检。 |
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