产品分类/PRODUCT CLASSIFICATION
| T7 RNA 聚合酶对T7噬菌体启动子具有高度的特异性，并可以其作为启动子，DNA作为模板体外合成正义链或反义链RNA。双链线性平末端或5’突出末端DNA均可作为T7 RNA 聚合酶的底物模板，因此线性质粒、PCR产物均可用作体外合成RNA的模板。 正义或反义RNA链取决于模板DNA序列与T7启动子的位置，DNA位于T7启动子的下游，T7 RNA聚合酶会转录出正义RNA，反之则为反义RNA链。 提供两种T7 RNA 聚合酶：野生型（A3601）和耐热型（A3603/A3604）。野生型T7 RNA 聚合酶可在37℃对模板进行高效体外转录，与野生型噬菌体 T7 RNA 聚合酶相比，T7耐热RNA聚合酶可在更高的温度下进行体外转录。它可在37-52℃条件下进行高效的体外转录，最佳温度为37℃，50℃反应条件下仍然保留50%以上的活性，而野生型在此温度下无活性。基于此耐热的体外转录反应特性具有以下优势：（1）提升了GC含量较高RNA的转录效率；（2）提升了长片段RNA的合成能力；（3）在使用帽类似物时，提高了共转录的加帽效率；（4）减少了 dsRNA 副产物的形成，降低了合成 RNA 的免疫原性; (5)提升NASBA和CRISPR核酸扩增检测性能。该系列酶均来自重组 E.coli BL21菌株纯化而得，无核酸酶污染。 T7高产RNA合成试剂盒是基于T7 RNA聚合酶而组建的试剂盒，产量超过 MegaScript T7 Transcription kit，可在体外高效合成多种类型的 RNA，如mRNA、lncRNA、shRNA等。利用T7 RNA 聚合酶2.0识别T7 promoter（TAATACGACTCA CTATA G G）以倒数第二个G碱基为起点开始转录，该试剂盒可以将少量样本进行高效转录，单次反应可获得高达150 μg 的产物，转录长度可达5000nt以上。利用该试剂盒得到的 RNA 适用于多种下游应用，如RNA结构和功能研究、核酸酶生物化学研究、RNase保护分析探针、印迹杂交、反义 RNA 及 RNAi 实验、微阵列分析、显微注射、体外翻译和 RNA 疫苗等。 | ||
应用 | ||
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1X T7 Transcription Buffer | ||
| 40 mM Tris (pH 7.8), 10 mM NaCl, 6mM MgCl2,2 mM Spermidine HCl, 10 mM DTT 。 | ||
酶储存液 | ||
| 10 mM Tris-HCl, 0.1 M NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 50% Glycerol, 0.01% (w/v) Triton X-100 , pH 7.5。 | ||
储存 | ||
| -20°C可保存2年，避免反复冻融。 | ||
热失活 | ||
| 75°C，10min。 | ||
注意事项 | ||
| 1. 转录DNA模板的种类：推荐使用含T7启动子的线性化质粒和PCR产物作为模板。 2. 转录模板的纯度会显著影响体外转录反应。在质粒DNA抽提过程中残留的RnaseA会显著影响转录RNA的质量。通过酚-氯仿抽提的质粒DNA为最佳模板。 3. 该酶对高浓度NaCl或KCl不耐受，当其浓度高于 150mM时，其活性受到显著抑制（~50%）。 4. 在20μl反应体系中加入0.02U热稳定无机焦磷酸酶可显著提高转录产量（提高25~50%）。 | ||
实例 | ||
| 1.野生型和耐热型T7 RNA聚合酶的耐热性能比较 以20ng DNA作为模板，分别在反应体系（20 μl）中加入100U的T7 RNA聚合酶和T7 耐热RNA聚合酶2.0进行体外转录，结果可见T7 耐热RNA聚合酶2.0在50°C仍具有较高活性，而野生型T7 RNA聚合酶在该温度下没有活性。 | ||
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| 2.热稳定无机焦磷酸酶对转录产量的影响 在反应体系（20 μl）中加入0.02U的热稳定无机焦磷酸酶（货号C5007）可显著提高转录产物的产量。 | ||
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| 3.以不同大小的线性化质粒作为模板，应用T7耐热RNA聚合酶2.0进行转录性能测试 由结果可见：T7耐热RNA聚合酶2.0在50°C条件下仍具有理想的转录活性。 | ||
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| 4.以不同大小的PCR产物作为模板，应用T7耐热RNA聚合酶2.0进行转录性能测试 由结果可见：T7耐热RNA聚合酶2.0可有效转录>5000nt的RNA分子。 | ||
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