3173 DNA Polymerase为来源于病毒的热稳定型DNA聚合酶，通过点突变修饰，使其3’-5’外切活性缺失（exo-形式）而获得更佳的扩增活性。该酶除了具有依赖于DNA的聚合酶活性，还具有依赖于RNA的逆转录活性，因此可用于单管RT-PCR扩增。该酶具有强烈的链置换活性，可用于DNA或RNA的等温扩增。在以RNA为模板的LAMP实验中，可实现单酶系统反应。对于有复杂二级结构的RNA模板，可通过92度加热3s来得到好的扩增效果，而Bst pol在此温度加热后导致扩增活性丧失。
3173 DNA 聚合酶在95°C条件下的半衰期为20min，因此PCR的起始预变性时间通常为1~2min。该酶搭配两种Buffer：10×3173 Isothermal Buffer和5×Best PCR Buffer。10×3173 Isothermal Buffer用于恒温PCR扩增，其反应温度不能超过70°C。 5×Best PCR Buffer用于常规PCR扩增，94°C预变性时间不可超过5min。 |
主要特征 |
- 同时具有较强的延伸能力和逆转录活性
- 耐热性能极强，对于复杂模板的扩增活性强
- 强烈的链置换活性，可应用于LAMP检测
|
组分 |
| 组分名称 | 数量 | | 3173 DNA Polymerase (5 U/μl) | 100 μl | | 10×3173 Isothermal Buffer | 1 ml | | 5×Best PCR Buffer | 1 ml | |
单位定义 |
| 一个活力单位即在65°C条件下，30分钟内催化25nmol dNTP的掺入反应成为酸不溶性物质所需的酶量。 |
应用 |
- 恒温PCR扩增
- DNA LAMP和RT-LAMP
- 链置换基因合成
- 在60-70度之间具有反转录活性，可用于单管RT-PCR
|
储存 |
| -20℃可保存3年。 |
使用方法 |
1.以DNA为模板进行PCR扩增 反应体系配制
3173 DNA Polymerase (5 U/μl) 1 μl
5×Best PCR Buffer 10 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each) 4 μl
模板DNA 1ng~1ug
上游引物（10 μM） 5 μl
下游引物（10 μM） 5 μl
ddH2O Up to 50 ul | PCR扩增循环参数 | 循环数 | 温度 | 时间 | | 1st Cycle | 90°C | 2min | | 25-40 Cycles | 90°C | 15s | | Tm | 15s | | 72°C | 1kb/1min | | Last Cycle | 72°C | 5min | | |
2.以RNA为模板进行RT-PCR扩增 反应体系配制
3173 DNA Polymerase (5 U/μl) 1 μl
5×Best PCR Buffer 25 μl
dNTP Mixture (10 mM each) 5 μl
模板RNA 10ng~1ug
上游引物（10 μM） 2 μl
下游引物（10 μM） 2 μl
ddH2O Up to 50 ul | PCR扩增循环参数 | 循环数 | 温度 | 时间 | | 1st Cycle | 60°C | 60min | | 35 Cycles | 90°C | 15s | | 57°C | 15s | | 72°C | 1kb/1min | | Last Cycle | 72°C | 5min | | |
| 3.缺刻恒温PCR扩增 | 3173 DNA Polymerase (5 U/μl) 1 μl
10×3173 Isothermal Buffer 5 μl
dNTP Mixture (10 mM each) 5 μl
模板DNA 10ng~1ug
引物（500 μM） 5 μl
ddH2O Up to 50 μl
55°C孵育2~8h。 | |
