上海细胞库
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| 规格 | 价格 | 库存 |
|---|---|---|
| 80T | ￥ 980 | 2 |
| 800T | ￥ 6800 | 2 |
描述：Multiplex PCR 又称多重 PCR ，是指在同一 PCR 反应体系里加上两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR 反应，已被广泛应用于科学研究和疾病诊断等多个领域，特别适用于微量样本的多位点检测。
本制品使用具有极强扩增性能的热启动 RAPA3G DNA聚合酶和优化的多重 PCR 反应缓冲液，使其可有效扩增20重以上的 PCR，具有极高的灵敏度，最大程度上减少了反应体系优化步骤。
特性
l RAPA3G DNA 聚合酶，扩增性能强，抗杂质能力极高
l 完全封闭的热启动特性，50°C 以下 100%无活性
l 优化的反应缓冲体系，避免非特异性扩增
l 高灵敏度，有效扩增 0.1ng 的人基因组 DNA（20 重）
组分
| 名 称 | 80Tx25µl | 800Tx25µl |
| 2×RAPA3G Multiplex PCR Mix | 1 ml | 1 ml x10 |
储存：长期储存置于-20°C 以下，可保存 2 年；短期使用置于 4°C（3 个月）保存。
使用方法
1. 按下表配制反应体系并混合均匀：
2×RAPA3G Multiplex PCR Mix 12.5 μl
10xPrimer mix 2.5 μl
*模板 DNA 0.1~100 ng
ddH2O upto 25 μl
*模板 DNA：人的基因组 100 ng，质粒 100 pg，cDNA 1-5 μl。
2. PCR 扩增循环参数
| 循环数 | 温度 | 时间 |
| 预变性 | 95°C | 5min |
|
30-35Cycles | 95°C | 20s |
| 57~60°C | 60s | |
| 72°C | 2kb/min | |
| 末延伸 | 72°C | 10min |
请注意：该制品为热启动制品预变性步骤 5min 不可缩短，否则 DNA 聚合酶无法恢复活性。
3. 电泳：1kb 以内的扩增产物建议使用 3%~4% 琼脂糖凝胶，电压使用 80V ，可以有效的分离各扩增片段。
4. 注意事项：
（1）当模板 GC 含量>70%时，请添加 5×Q-Solution。
（2）推荐引物设计原则：引物长度保持在 22 - 30 bp，扩增产物长度在 2kb 以下，GC 含量 50% - 60%，尽量减少各引物之间 TM 的差值。
（3）检测单引物特异性：多重 PCR 反应前，应对设计的引物逐一扩增，以确定是否有非特异性扩增和扩增效率。
（4）引物推荐使用浓度：推荐扩增片段<300bp 每条引物的反应终浓度为 0.2-0.3 μM，扩增片段>300bp 每条引物的反应终浓度为 0.05-0.15 μM，如某些目标片段产量偏低或偏高，可适度调整其对应引物使用量以优化反应结果。
（5）反应前需将引物制成 10×Primer Mix：
| 引物储存液 | 用量 | 10x 浓度 |
| 引物 1 F（100μM） | 1 μl | 1 μM |
| 引物 1 R（100μM） | 1 μl | 1 μM |
| 引物 2 F（100μM） | 0.5 μl | 0.5 μM |
| 引物 2 R（100μM） | 0.5 μl | 0.5 μM |
| …………. |
|
|
| 引物 n F（100μM） | 3 μl | 3 μM |
| 引物 n R（100μM） | 3 μl | 3 μM |
| ddH2O Upto | 100 μl |
|
常见问题及解答：
1. 扩增产物少或没有扩增。
(1) 降低退火温度（每个梯度降低 1°C）。
(2) 增加模板量
(3) 增加 PCR 循环数。
(4) 增加退火时间为 90 sec，必要时可延长退火时间至 3 min。
(5) 增加引物使用量。
2. 存在非特异性扩增。
(1) 减少循环数，提高退火温度（每个梯度降低 1°C）。
(2) 减少引物使用量。
(3) 重新设计引物。
3. 电泳时条带模糊。
(1) 减少循环数(每次减少 3 个循环)。
(2) 减少起始模板量。
(3) 延长彻底延伸步骤时间至 15 - 30 min。
(4) 减少退火时间。
