HiFi One-Step RT-PCR Mix-上海雅吉生物科技有限公司

本试剂采用稳定高效的RT-PCR预混体系，是以RNA为模板进行一步法RT-PCR的专用试剂。其原理为用基因特异性引物进行反转录反应，获得第一链cDNA（不可使用Oligo（dT）或Random Rimer合成第一链cDNA），再使用基因特异性正向引物和反向引物进行PCR扩增，在同一反应体系中一步完成从反转录到PCR的全部过程。反应体系中已含有电泳所需的指试剂（蓝色和黄色），反应后可以直接进行电泳。
在本试剂中，将耐热M-MLV反转录酶、Rnase Inhibitor、Hotstart高保真DNA聚合酶以及稳定剂等配制成50×One-Step Enzyme Mix预混液；反应Buffer、dNTP以及电泳指示染料配制成5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer，因此使得操作更加简单便，扩增产物可用于平端克隆和DNA测序。

组分

组分名称	250T
50×One-Step Enzyme Mix	100 μl
5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer	1 ml
RNase Free H₂O	1 ml×3

注意：1.50×One-Step Enzyme Mix粘度高，第一次使用之前要离心收集至反应管底部，吸取时应缓慢小心。
2.由于使用了Hotstart高保真DNA聚合酶，反应配制可在常温进行，但各组分应-20°C保存。

主要特征

耐热M-MLV反转录酶可在55℃反应能更好的打开复杂二级结构，只需10min即可完成逆转录。
DNA聚合酶为热启动型高保真酶，能够有效的抑制非特异性反应且具有较高的校正活性，酶激活仅需2min。
具有宽泛的模板量兼容性，10 ng~1μg都可有效扩增。
反应过程中无需开盖，避免了操作过程中的污染危害。

储存

请置于-20°C，可保存2年；避免反复冻融。

实例

1.以Hela细胞总RNA为模板，使用HiFi One Step RT PCR Mix扩增不同长度的目的片段。电泳结果显示，166bp～4128bp 的 DNA 片段都得到了良好的扩增。

基因名称	模板使用量
gDNA：500bp、2kb、5kb、8kb、12kb	≤2kb 50ng 2kb~8kb 100ng ＞8kb 200ng
λDNA：500bp、1kb、2kb、5kb、8kb、15kb、20kb	50 ng
Hela cDNA：166bp、552bp、1574bp、1705bp、2755bp、4128bp	≤2kb 相当mRNA 50ng ＞2kb 相当mRNA 200ng

>1000 bp	1000~3000 bp	>3000 bp
55°C，10min	55°C，10min	55°C，10min
95°C，2min	95°C，2min	95°C，2min
95°C，20s 58°C，20s 72°C，30s32cycles	95°C，20s 58°C，20s 72°C，1min20s32cycles	95°C，20s 58°C，20s 72°C，2min 5s32cycles
72°C，2min	72°C，2min	72°C，2min

M：D10000 DNA Marker，1-7分别为：β-actin(166bp)、GAPDH (552bp)、GAPDH(960bp)、BMP2 (1574bp)、PRKN (1705bp)、TFRC (2755bp)和TFRC( 4128bp)。

2. 以Hela细胞总RNA为模板，使用不同的RNA模板量（1 ng、10 ng、50 ng、100 ng、200 ng、400 ng、600 ng、800 ng、1 μg）进行HiFi One Step RT PCR Mix扩增。电泳结果显示，三种不同长度的片段都获得良好的扩增，过多的模板可能会抑制扩增。

960bp	1574bp	4128bp
55°C，10min	55°C，10min	55°C，10min
95°C，2min	95°C，2min	95°C，2min
95°C，20s 58°C，20s 72°C，30s32cycles	95°C，20s 58°C，20s 72°C，1min20s32cycles	95°C，20s 58°C，20s 72°C，2min 5s32cycles
72°C，2min	72°C，2min	72°C，2min