Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒-上海雅吉生物科技有限公司

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500T	￥ 980	1

Calcein-AM/PI 活细胞/死细胞双染试剂盒说明书

货号：YS1630M

规格：500T

保存：-20°C 避光干燥保存，一年有效。

产品内容：

名称	规格	保存
Calcein-AM Solution(2mM)	50μL	-20°C 避光干燥保存
PI Solution (1.5 mM)	150μL	-20°C 避光干燥保存
10×Assay Buffer	50mL	-20℃保存，经常使用可放在 4℃保存。

产品说明：

Calcein-AM 是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，发绿色荧光 ( Ex=490nm, Em=515nm) 。因其在传统的 Calcein (钙黄绿素) 基础上引入乙酰甲氧基甲酯 (AM) 基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后，Calcein-AM (本身不发荧光) 被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子 Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。与其它同类试剂 (如 BCECF-AM 和 CFDA)相比，由于 Calcein, AM 细胞毒性极低，是最适合用于活细胞染色的荧光探针，而且不会抑制任何的细胞功能，如增殖和淋巴球的趋化性。

由于死细胞缺乏酯酶，Calcein-AM 仅用于对活细胞的细胞生存能力测试和短期标记。因此， Calcein-AM 常常与死细胞荧光探针如碘化丙啶 (PI) 等联合使用，同时进行活细胞和死细胞的荧光双重染色。碘化丙啶 (Propidium iodide ，PI) 不能穿过活细胞的细胞膜，仅能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的 DNA 双螺旋从而产生红色荧光 (Ex=535 nm, Em=617 nm)，因此 PI 仅对死细胞染色。由于 Calcein 和 PI-DNA 都可被 490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。而用 545 nm 激发，仅可观察到死细胞。

本试剂盒的工作原理就在于 Calcein-AM 和 PI 的双重染料，来进行活细胞和死细胞的双重染色标记，从而进行活细胞和死细胞水平的分析。根据我司优化的实验体系，单次就 200µL 细胞悬液进行染色，可以做 500 次检测。

使用方法 (仅供参考)：

1. 工作液的前处理

( 1) 从低温冰箱内取出 10×Assay Buffer，根据单次用量无菌条件取出适量，用去离子水 10 倍稀释以得到 1×Assay Buffer。

(2) 由于 Calcein-AM 的稳定性受温度影响较大，建议收到货后，可分装为小份，密封避光保存于 -20℃ ，不能反复冻融。若染色液经稀释，建议当天用完。

2. 细胞处理

( 1) 悬浮生长的细胞，收集至离心管，450g ，离心 5min ，去除上清。用 1x 的 Assay Buffer 洗涤细胞，450g ，离心 5min ，2 次，去除残留酯酶。

(2) 贴壁细胞经 0.25%胰酶-EDTA 消化后，收集细胞，用 1x 的 Assay Buffer 洗涤细胞，450g ，离心 5min ，2 次，去除胰酶及残留的酯酶。

3. 染色步骤

( 1) 离心得到的细胞沉淀用 1×Assay Buffer 重悬，使重悬后细胞悬液计数细胞量为 1×105~6 个/ml。

(2) 每 1ml 的细胞量加入 1-2ul 的 Calcein-AM (原液)，吹打混匀，37℃避光孵育 20min-25min。

(3) 将试剂盒自带的 PI 原液取 3-5ul 加入上述染色细胞中，室温避光染色 5min。

(4) 孵育荧光后的细胞，450g ，5min ，离心去除染色液。注：细胞进行荧光染色时建议全程避光。

(5) 用 1x 的 PBS 清洗细胞 450g ，5min ，离心后用 1x PBS 重悬细胞，取 3-5ul 滴在洁净的载玻片上，用干净的盖玻片压片后，请及时荧光镜检。

(6) 荧光显微镜下使用 490± 10 nm 激发滤片同时检测活细胞 (黄绿色荧光) 以及死细胞 (红色荧光)。另外，使用 545nm 的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行检测。

注意事项：

( 1) 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

(2) 贴壁细胞也可以不消化，直接去除培养基，经 1×Assay Buffer 浸洗 2min ，2 次。按上述细胞量和染色液浓度比例进行染色，染色时间和染色液工作浓度可按实际检测调整。

(3) Calcein-AM 作用于细胞，一般细胞量在 1×105-6 个时，Calcein-AM 的工作浓度基本在 1-2µM； PI 的工作浓度在 5µM 。但由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定 Calcein-AM 和 PI 的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到最好的荧光结果。