使用目的：

本试剂盒用于测定昆虫样本中几丁质(chitin)含量。

实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中昆虫几丁质(chitin)水平。用纯化的昆虫几丁质(chitin)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入几丁质(chitin),再与HRP标记的几丁质(chitin)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的几丁质(chitin)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中昆虫几丁质(chitin)浓度。

试剂盒组成

标本要求 

1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融

2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤

1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。   

4. 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7. 温育：操作同3。

8. 洗涤：操作同5。

9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟.

10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。 

计算

  以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项

1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4． 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。

5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物请避光保存。

7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9．本试剂不同批号组分不得混用。

保存条件及有效期

1．试剂盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6个月

文献参考：文章标题：miR-2765 Modulates the Seasonal Polyphenism in Cacopsylla chinensis by Targeting a Novel Cold Rreceptor CcTRPC3

作者列表：Jianying Li, Dongyue Zhang, Zhixian Zhang, Shili Meng, Bo Wang, Zhen Li, Xiaoxia Liu, Songdou Zhang

发表时间：2023-12-20

期刊：JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY

影响因子：6.1

DOI:10.1021/acs.jafc.3c05429

Abstract Image

Polyphenism is a beneficial way in organisms to better cope with changing circumstances and is a hot topic in entomology, evolutionary biology, and ecology. Until now, this phenomenon has been proven to be season-, density-, and diet-dependent; however, there are very few reports on temperature regulation. Cacopsylla chinensis showed seasonal polyphenism, namely as summer- and winter-form, with obvious diversity in phenotypic characteristics in response to seasonal variation. Previous studies have found that low temperature in autumn is an extremely important element in inducing summer-form change to winter-form, but the underlying regulatory mechanism is still a mystery. Herein, we provided the initial evidence that the third instar of the summer-form is the critical period for developing to the winter-form, and 10 °C induces this transition by affecting the total pigment, chitin level, and thickness of the cuticle. Second, CcTPRC3 was proven to function as a novel cold receptor to control this seasonal polyphenism. Moreover, miR-2765 was found to mediate seasonal polyphenism by inhibiting CcTRPC3 expression. Last, we found that cuticle binding proteins CcCPR4 and CcCPR9 function as the downstream signals of CcTRPC3 to regulate the seasonal polyphenism in C. chinensis. In conclusion, our results displayed a novel signal pathway of miR-2765 and CcTRPC3 for the regulation of seasonal polyphenism in C. chinensis. These findings provide insights into the comprehensive analysis of insect polyphenism and are useful in developing potential strategies to block the phase transition for the pest control of C. chinensis.

Copyright © 2023 American Chemical Society