使用说明:
1. 细胞的准备:使用适合进行化学发光检测的96孔板,每孔接种100μl细胞(如使用384孔板,每孔接种25μl细胞,具体用量视不同类型的 384孔板而定),并确保检测时每孔的细胞数量在3万个以内(如使用384孔板宜控制在6千个以内),同时设置不含细胞的培养液孔作为阴性对照,按照细胞培养的常规方法培养细胞。如有需要,可加入药物处理细胞。此外,如有必要,也可以设置细胞的浓度梯度,以便后续确定试剂盒的使用效果。
2. ATP标准曲线的设置(选做):把自备的ATP标准溶液用PBS或细胞培养液稀释成适当的浓度梯度。初次检测可以设置0、3、10、30、100、300、1000、3000nM这几个浓度,96孔板每孔加入100μl的标准品。如有必要,在后续的实验中可以根据细胞中的ATP含量对标准品的浓度范围进行适当调整。如果用细胞培养液来稀释ATP标准品,稀释后需立即进行后续的发光检测,否则培养液中的ATPase等可以消耗ATP的酶会导致ATP含量下降。
3. 检测试剂的准备:
a. 融解冻存的CellTiter-Lumi Steady发光法检测试剂,如有必要可适当分装该试剂。经测试反复冻融5次对其检测效果无显著影响。
b. 按照96孔板每孔100μl (384孔板每孔25μl)的量,取适量CellTiter-LumiSteady发光法检测试剂,平衡至室温。
4. 细胞活力检测:
a. 取出细胞培养板在室温平衡10分钟(通常不宜超过30分钟)。
b. 96孔板每孔加入100μl CellTiter-LumiSteady发光法检测试剂(384孔板每孔25微升)。
c. 室温振荡2分钟,以促进细胞的裂解。
d. 室温(约25ºC)孵育10分钟,使发光信号趋于稳定。
e. 使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光检测。请根据仪器要求设置相应的参数,每个孔的检测时间一般为0.25-1秒或更长时间,具体需根据仪器的检测灵敏度进行适当的调整。
根据化学发光读数直接计算细胞的相对活力,或根据ATP标准曲线计算出ATP的量从而计算出细胞的相对活力。