上海细胞库
人源细胞系| 稳转细胞系| 基因敲除株| 基因点突变细胞株| 基因过表达细胞株| 重组细胞系| 猪的细胞系| 马细胞系| 兔的细胞系| 犬的细胞系| 山羊的细胞系| 鱼的细胞系| 猴的细胞系| 仓鼠的细胞系| 狗的细胞系| 牛的细胞| 大鼠细胞系| 小鼠细胞系| 其他细胞系|
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| 规格 | 价格 | 库存 |
|---|---|---|
| 50T | ￥ 4800 | 2 |
【产品名称】
通用名称：禽流感病毒H5亚型RT-PCR检测试剂盒
【预期用途】
本试剂盒适用于禽流感病毒检测，定性检测禽流感病毒H5亚型，对禽流感病毒引起的流感及其并发症的诊断及疗效评估有重要指导意义。
【检验原理】
利用离心柱内硅基质膜提取RNA，在反转录酶的作用下，以RNA为模板，以引物为起点合成与RNA模板互补的cDNA链。在TaqDNA聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火、中温延伸的循环，使特异DNA片段的拷贝数放大一倍。经过35次循环，最终使扩增DNA片段放大了数百万倍。将扩增DNA片段进行电泳，经染色后，在紫外灯照射下，肉眼可见到DNA片段的扩增带。
【主要组成成份】
| 序号 | 组成 | 50T/盒 |
| 1 | 禽流感H5 RT-PCR反应液 | 750 μL×1管 |
| 2 | 禽流感H5 混合酶液 | 150 μL×1管 |
| 3 | 禽流感H5 阳性对照 | 40 μL×1管 |
| 4 | 禽流感H5 阴性对照 | 40 μL×1管 |
| 5 | 说明书 | 1份 |
注：阴性对照为禽类基因组DNA，阳性对照为失去活性的禽流感病毒H5亚型cDNA。
【储存条件及有效期】-20℃以下保存，避免反复冻融，有效期12个月。
【需自备的物品】PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪、可调移液器、琼脂糖等相关试剂及设备。
【注意事项】
1.病毒具有很强的感染能力，操作前必须准备好各种防御措施。
2.操作时须严格按照步骤进行，废物必须放入含消毒液的废物缸，以免污染实验室和工作人员。
3.为避免其他核酸的污染而出现假阳性，必须使用不含DNA和RNA的离心管、吸管、枪头、试剂和手套，操作人员须戴口罩。
【实验准备】
如果是提取病毒RNA，请选用RNase free Tip枪头和1.5 ml离心管或将枪头和离心管用0.1% DEPC水处理后再使用。
【操作步骤】
1.样品处理：每份样品分别处理。
（1）无细胞体液样品处理：收集200 µL样品，转入到1.5 ml离心管中；
（2）全血样品处理：待血凝后取血清 200 µL , 转入到1.5 ml离心管中；
（3）组织样品处理：每份组织分别从三个不同的位置称取样品约 1g ，用手术剪碎混匀后取 ，用手术剪碎混匀后取 0.05 g于研磨器中，加入1.5 mL生理盐水继续充分研磨，待匀浆后转至1.5 mL 灭菌离心管中，12,000 rpm离心 5 min，取上清液 200 µL 于1.5 mL离心管中。
2. 提取过程
用QIAGEN、Roche公司RNA提取试剂盒提取RNA，具体操作按照其试剂盒说明书操作。
3. RT-PCR扩增
（1）每份总体积20 µL，含15 µL RT-PCR反应液（用前混匀），3µL 混合酶液，2 µL模板RNA。
例如：n份样品，配制n+1份，15×（n+1）RT-PCR反应液， 3×（n+1）混合酶液匀后取18 µL分装成n份，分别加入2 µL模板RNA，作好标记。
（2）在PCR扩增仪上进行以下程序：50 ℃ 10 min，94 ℃ 3 min；循环94℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35次；再72 ℃延伸7 min。
4. 电泳
称1.5 g琼脂糖放于500 mL锥形瓶中，加入1倍TAE电泳缓冲液100 mL（取2 mL 50倍TAE电泳缓冲液，用双蒸水稀释至100 mL），于微波炉中熔解，待冷却至50℃左右再加入50 µL染色液（自备）混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将PCR扩增产物中加入4µL上样缓冲液（自备）混匀后取10 µL点样于琼脂糖凝胶孔中，以110～120V电压于1倍TAE电泳缓冲液中电泳，紫外灯下观察结果。（注：染色液是2000×，上样缓冲液是6×）
【结果判定】
阳性对照出现219 bp扩增带、阴性对照无带出现（引物带除外）时，实验结果成立。被检样品出现219 bp扩增带为禽流感病毒H5亚型阳性，否则为阴性。
