产品分类/PRODUCT CLASSIFICATION
MycoBlue Kit是针对细胞培养物支原体污染快速检测的试剂，使用简便快捷，只需吸取1 μl细胞培养液上清加入反应体 系中，60℃孵育1 h，肉眼观察即可判定结果。无需PCR/qPCR仪，无需电泳，在细胞房内即可轻松完成。与常用的PCR法 相比MycoBlue Kit对培养液上清中的抑制物耐受度更强，因此不会出现弱阳性、假阴性；反应完成后无需开盖电泳，避免了 扩增产物气溶胶造成的假阳性；检测结果与目前最灵敏、最准确的qPCR法具有极高的一致性。
经验证，MycoBlue Kit可检测多达28种支原体，其中包括细胞培养常见的8种支原体；适用于各种悬浮、贴壁培养细 胞，包括CHO 、Vero 、杂交瘤、Sf9 、293等，且具有广泛的培养基兼容性，因此非常适合于生物制药企业、疫苗生产企 业、单抗生产企业、 细胞治疗/胚胎实验室以及科研实验室的日常支原体检测。
支原体检测试剂盒（发光法）产品组分
| 组 分 | FH8003 (50 rxns) |
| MycoBlue Buffer | 1.2 ml |
| MycoBlue Enzyme | 50 μl |
| Positive Control | 25 μl |
| Paraffin Oil | 1.25 ml |
*包含显色剂。
保存条件
-30 ~ -15℃保存，≤0℃运输。
自备材料
PCR仪或水浴锅。
注意事项
试剂保存过程中拧紧管盖，保持密封。
适用范围
MycoBlue Kit适用于各种悬浮、贴壁培养细胞，并对培养基、血清种类具有广泛兼容性。经验证的细胞和培养基血清包 括(但不限于)： 悬浮细胞：CHO 、NS0 、293F、小鼠杂交瘤、Sf9 、BHK21 、THP-1 、raji等；
贴壁细胞：Vero 、MDCK 、SP2/0 、293T 、HepG2 、HeLa 、A549 、MB-MDA231 、L929 、MEF等；
培养基：CD FortiCHO 、CDM4 、Expi 293 Medium 、CD Hybridoma 、Grace 、DMEM 、1640 、F12等； 血清：胎牛/小牛血清、马血清、Gibco KSR血清替代物等。
支原体检测试剂盒（发光法）实验流程
1. 获得细胞培养液上清
贴壁细胞：直接吸取上清。建议在细胞传代或换液3天以上，并且汇合度达到90%左右时取样，此时上清中支原体含量较高，便于检出。 悬浮细胞：2,300 rpm(500 × g)离心5 min后，吸取上清。建议在细胞传代或换液3天以上时取样，此时支原体含量较高，便于检出。
2. 配制反应体系
将MycoBlue Buffer从-30~ -15℃取出，待解冻后，颠倒混匀。根据待检测样品数量在微量离心管中配制如下反应体系:
| 组 分 | 单次反应体积(μl) |
|
| MycoBlue Buffer MycoBlue Enzyme | 24 1 | × 样品数a × 1.1b |
a.可根据需要，每次实验加上一个阴性对照、一个阳性对照；
b.移液器存在移液误差，建议按照实际反应数1.1倍配制混合液，以弥补损耗。
用移液器轻轻吹打混匀，分装到PCR管或微量离心管中，每支反应管25 μl。
3. 加样
样品：向反应管中加入1 μl待测培养液上清 阳性对照：加入1 μl Positive Control
阴性对照：不加入任何样品或加入1 μl Nuclease-free ddH2O
▲如果反应是在水浴锅中进行，则在每管中加入25 μl Paraffin Oil，以防止液体蒸发导致结果不准确。加入Paraffin Oil时请注意更换枪头，防止样品之间交 叉污染。
▲如果反应是在PCR仪中进行，不需要加入Paraffin Oil。
4. 反应
将水浴锅或PCR仪温度设置成60℃,放入反应管，孵育60 min。
▲水浴锅实际温度可能与设置温度有所偏差，建议先用温度计进行校准。实际上58 ~ 64℃反应都可以进行，但会影响检测灵敏度。
▲不建议使用烘箱进行反应。
5. 结果判定
在一个光线良好的环境中观察反应液颜色(建议以白纸为背景)。如果反应液颜色仍为紫色，则判定为支原体阴性；如果反应液颜色变成天 蓝色，则判定为支原体阳性。在少数情况下(如支原体含量较低)，反应液颜色可能会介于紫色和天蓝色之间，此时可将反应时间持续延 长到75 - 90 min，如果颜色变为天蓝色，则判定为阳性，否则判定为阴性。颜色反应如下图所示，以阴性对照与阳性对照作为参考。
阴性 阳性
▲反应产物不可开盖，否则产生的气溶胶会导致后续检测假阳性的出现。建议将反应管包扎在塑料袋或手套中 ，丢弃到专用垃圾桶中，并及时清理。
支原体检测试剂盒（发光法）常见问题及解决方案
MycoBlue Kit 的灵敏度是多少？如何保证检测灵敏度？
MycoBlue Kit 可从1 μl培养液上清中准确检出至少500 cfu的支原体，即灵敏度为5 × 105 cfu/ml 。通常情况下，培养 液上清中的支原体 含量在106 - 108 cfu/ml之间，该试剂可以满足绝大多数实验的需要。据文献报道，单个支原体感染细胞后，在3 - 5天 内可增殖至106 cfu/ml 。因此，建议在换液或传代3天后再进行检测。
加入培养基上清后，反应液立即变色；或者反应结束后，反应液颜色呈现紫色与天蓝色以外的颜色，是什么原因？如何解决？
在极少数情况下，培养基成分会对MycoBlue试剂的颜色产生干扰，比如Cell Boost 5(Hyclone)会使MycoBlue试剂呈现出粉红色。
处理方法：①取少量培养液上清或细胞悬液，2,300 rpm(500 × g)离心5 min，收集上清；②高速离心(>11,200 rpm (12,000 × g))5 min， 使上清中可能存在的支原体沉淀。弃掉大部分上清，保留约50 μl；再加入950 μl Nuclease-free ddH2O，用移液器吹打混匀；③重复 步骤②三次，弃掉大部分上清，保留约50 μl；④取1 μl进行检测。
操作过程中如何避免出现假阳性？
最重要的是反应结束后，避免开盖，否则反应产物会产生气溶胶污染，导致后续检测出现假阳性。另外，加样时注意更换枪头， 并将 阳性对照放在最后一管加入，也可以进一步降低假阳性出现的风险。
如果出现支原体污染如何补救？
若发现细胞存在支原体污染，建议直接丢弃，防止污染其它细胞。可尝试使用支原体清除剂，对细 胞进行挽救。
MycoBlue Kit 可以检测多少种支原体？
MycoBlue Kit 可以准确检出28种支原体：
| A. laidlawii* | M. salivarium* | M. neophronis | M. primatum | M. gallinarum | M. lipophilum |
| M. hominis* | M. pirum* | M. timone | M. leopharyngis | M. sphenisci | M. falconis |
| M. arginini* | M. orale* | M. caviae | M. maculosum | M. bovigenitalium | M. alkalescens |
| M. fermentans* | A. granularum | M. alvi | A. oculi | M. auris |
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| M. hyorhinis* | A. pleciae | M. bovis | M. iners | M. columbinum |
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*超过95%以上的细胞是被这8种支原体所污染。
