注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
植物细胞壁中的果胶是植物初生细胞壁的主要成分，除了起结构支撑、物质运输等作用外，还具有抵抗逆
境的作用。果胶甲酯化程度影响了细胞壁的坚韧程度及其抗性。
测定原理
果胶甲酯键经皂化处理后释放出甲醇，甲醇与 2,4-戊二酮反应显色，在 412nm 下测定吸光值；同时半乳糖
醛酸在 70℃下与浓硫酸反应生成 5-甲酰基-2-呋喃甲酸，5-甲酰基-2-呋喃甲酸与 3,5-二甲基苯酚反应产生有
色物质，在 450nm 下有最大吸光值。以甲醇生成量与半乳糖醛酸含量的比值代表果胶甲酯化程度。
自备实验用品及仪器
天平、低温离心机、酶标仪、96 孔板、恒温水浴锅、蒸馏水、硫酸。
试剂组成和配制
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 3mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 3mL×1 瓶，4℃保存。
试剂三：液体 3mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂四：液体 2.5mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂五：粉剂×1 瓶，4℃避光保存；临用前加入 22mL 试剂六充分溶解待用，用不完的试剂 4℃避光保存。
试剂六：液体 25mL×1 瓶，4℃保存。
试剂七：液体 3mL×1 瓶，4℃保存。
试剂八：液体 2.5mL×1 瓶，4℃避光保存。
酶液提取
称取约 0.1g 组织，加入 1mL 蒸馏水，进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min，弃上清，留沉淀。沉淀中加
入 1mL 提取液，混匀后 90℃水浴 2h，冷却至室温，10000g4℃离心 10min，取上清待测。
测定操作表
1.甲醇生成量测定
试剂名称（μL）
空白管
测定管
样本
50
提取液
50
试剂一
25
25
混匀，室温静置 30min
试剂二
25
25
试剂三
20
20
混匀，冰浴至紫色褪去，约需要 15-30min
试剂四
20
20
水
60
60
混匀，室温反应 1h
试剂五
200
200
混匀，60℃反应 15min。取 200μL 加入 96 孔板，测定 412nm 下吸光值 A
测定与 A 空白。△A1=A 测定-A 空白
2. 半乳糖醛酸含量测定
试剂名称（μL）
测定管
样本
25
试剂七
25
浓硫酸
400
70℃水浴 10min，冷却至室温
试剂八
20
充分混匀，静置 10min 后取 200μL 于 96 孔板测定 450nm 处吸光值 A1 与
400nm 吸光值 A2，△A2=A1-A2。
计算公式
1.甲醇生成量计算
标曲为 y = 0.0298x + 0.009，R2 = 0.9997；x 为标准品浓度，μmol/mL；y 为吸光值△A1。
甲醇生成量（μmol/g 鲜重）=（ΔA1-0.009） ÷0.0298÷W×V 样总
=33.56×（ΔA1-0.009）÷W
2.半乳糖醛酸含量计算
标准曲线为 y = 0.2585x - 0.1746，R2 = 0.9986；x 为标准品浓度，μmol/mL；y 为吸光值△A2。
半乳糖醛酸（μmol/g 鲜重）=(ΔA2+0.1746) ÷0.2585÷W×V 样总
=3.87×(ΔA2+0.1746)÷W
果胶甲酯化程度（%）=甲醇生成量÷半乳糖醛酸含量×100%
V 样总：加入提取液体积，1mL；W，样本质量，g
