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| 规格 | 价格 | 库存 |
|---|---|---|
| 50 μl×50 rxn | ￥ 2580 | 1 |
FastKing One Step RT-qPCR Kit (SYBR)
FastKing 一步法反转录-荧光定量试剂盒
(SYBR Green)
产品内容
| 产品组成 | FP313-01 50μl×50 rxn |
| 2×FastKing RT-qPCR Buffer(SYBR Green) | 1.25 ml |
| 25×RT-PCR Enzyme Mix | 100 μl |
| 50×ROX Reference Dye | 250 μl |
| RNase-Free ddH₂O | 1 ml |
储存条件
请将该试剂盒置于-30~-15℃避光保存，保质期1年。
适用的Real Time PCR扩增仪
ABI PRISM 7000/7700/7900HT,7300/7500,7500 Fast,ViiA 7,QuantStudioTM, StepOne'"/StepOne PlusT,12K Flex(Applied Biosystems)
OPTICONTM,CFX 系列 (BIORAD)
Smart Cycler System(Cepheid)
Mx3000 P/M×3005P(Stratagene)
Line-Gene(Bioer, 杭州博日)
Roche系列
其他各种Real Time PCR扩增仪
产品简介
本制品是采用SYBR Green l嵌合荧光法进行Real Time One Step RT-qPCR的专用试 剂。使用本制品进行Real Time One Step RT-qPCR反应可在同一反应管内连续进行，操作 简单，避免了样品间交叉污染的同时也提高了检测的灵敏度。
本试剂盒中的25×RT-PCR Enzyme Mix为TIANGEN 新型逆转录酶(FastKing RTase)、 新型抗体修饰热启动Taq DNA聚合酶和RNase Inhibitor的预混Mix形式，其中的FastKing RTase, 是分子改造后的新型逆转录酶，特别增加了疏水motif,具有更强的RNA 亲和性和热 稳定性，提高了该酶的逆转录效率和对具有复杂二级结构RNA模板的延伸能力；PCR 过程中 采用了性能优良的新型热启动Taq DNA聚合酶，使得逆转录后的PCR 反应具更高的扩增效率 和特异性。另外，本产品中的2×FastKing RT-qPCR Buffer (SYBR Green)是专门为上述两 种关键酶而优化的新型反应体系，其中包含必要离子组分、dNTPs、SYBR Green染料以及 One Step 稳定剂和增强剂，可保证FastKing RTase和新型热启动Taq DNA聚合酶在整个一 步法反应过程中发挥优良功效。
本制品可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对多种高低丰度的靶基因进行准 确定量检测，重复性好，可信度高。
产品特点
提高反应效率：性能优良的逆转录酶和Taq酶保证了高的反应效率；
操作简单快速：双组分的产品形式使得操作过程变得简单快速；
通读复杂模板：能够作用于GC 含量高，二级结构复杂的RNA模板；
样品普适性高：对不同物种来源及杂质较多的RNA模板的适用性高。
用户自己需要准备的
1.引物；
2.模板；
3.一次性手套及其它耗材；
适用范围
RT-qPCR 技术可用于检测细胞和组织中的基因表达水平及RNA病毒的含量。
操作步骤
1. 完全融化模板RNA, 特异性引物，2×FastKing RT-qPCR Buffer (SYBR Green), 50×ROX Reference Dye和RNase-Free ddH₂O,短暂离心后置于冰浴上。
2.按下表在冰浴条件下配制反应液：
|
| 体积/反应 |
| 2×FastKing RT-qPCR Buffer(SYBR Green) | 25μl |
| 25×RT-PCR Enzyme Mix | 2μl |
| 上游特异性引物(10 μM) | 1.25μl*¹ |
| 下游特异性引物(10μM) | 1.25μl*1 |
| RNA模板 | 10 pg-1 μg total RNA |
| 50×ROX Reference Dye"² | 根据不同仪器添加 |
| RNase-Free ddH₂O | 补水至50μl |
| 总体系 | 50μl |
引物终浓度为0.25μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。扩增效率不高时，可增加 PCR 反应体系中的引物浓度；发生非特异扩增时，可适当减少PCR 反应体系中的引物浓 度。需要进一步优化引物浓度的，可以在0.05-0.90 μM范围内调整。
2几种常见仪器的匹配ROX Reference Dye浓度见下表：
| 仪器 | 终浓度 |
| ABI 7000/7300/7700/7900/7900HT/7900HT Fast、 StepOneᴹ/StepOne PlusTM | 5×(例如：5μl ROX1/50μl体系) |
| ABI7500/7500 Fast、ViiA7、 QuantStudioTM 3/5/6 Flex/7 Flex/12K Flex; Agilent Stratagene M×3000P/M×3005P/M×4000 |
1×(例如：1μl ROX150 μl体系) |
| Roche仪器，Bio-Rad仪器，Eppendorf仪器等 | 不用添加 |
3.进行Real Time One Step RT-qPCR反应
PCR 反应管请用离心机瞬时离心后放入荧光定量PCR 仪中进行Real Time PCR反应。建 议采用下列图表显示的标准PCR 反应程序，如果使用该程序得不到良好的实验结果时，再进 行PCR 条件的优化。
反应步骤(建议)
| 反应温度 | 反应时间 | 反应循环数 | 说明 |
| 50℃ | 30 min | 1 | 逆转录 |
| 95℃ | 3 min | 1 | 预变性 |
| 95℃ | 15 sec | 40 | PCR循环步骤， |
| 60℃ | 30 sec | 请在该步骤收集荧光 | |
| 熔解曲线分析(Melting/Dissociation Curve Stage) | |||
4. 实验结果分析
反应结束后确认Real Time One Step RT-qPCR的扩增曲线、熔解曲线、CT 值、标准曲 线 等，并进行qRT-PCR 定量结果分析。
注意事项
1.RNA 模板可以采用总RNA 或mRNA, 建议使用TIANGEN 公司生产的TRNzol,RNAprep Pure 或RNA Easy Fast系列制备高质量的总RNA。
2.一 步法RT-qPCR 实验应避免RNase 污染，可采用以下措施：
1)因人的皮肤表面和唾液都有RNase, 因此实验中应佩戴一次性手套和口罩；
2 ) 一 步 法RT-qPCR 实验应使用专门的仪器和耗材，建议在专门区域操作RNA;
3 ) 一 步 法RT-qPCR 实验相关耗材应用0.1% DEPC (焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃ 处理12 h, 并高压灭菌30 min后使用。
3.25×RT-PCR Enzyme Mix在取用之前应短暂离心收集溶液后再吸取，吸取时动作要慢， 使用后应尽快放回-30~-15℃。
4.2×FastKing RT-qPCR Buffer (SYBR Green)在取用前应充分混匀并离心后使用。
