规格 | 价格 | 库存 |
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50T | ¥ 0.00 | 200 |
收到SuperReal 荧光定量预混试剂 增强版后,请立即置于-20℃避光保存。从-20℃取出使用时,将冻存的2×SuperReal PreMix Plus 和50×ROX Reference Dye融解,然后轻轻颠倒混匀,待溶液完全均一后再行使用。如解冻后没有使用,须彻底混匀后重新冷冻(在解冻过程中盐会出现分层现象,未混匀进行冷冻,盐晶体的析出将会对酶造成损害)。如需一段时间内经常取用,可在2~8℃条件下储存3个月。避免反复多次冻融。
本产品是采用SYBR Green I嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂。产品中预先混有Real Time PCR反应所需合适浓度的SYBR Green I,是一种2×浓度的PreMix,反应液配制十分简单方便。
SuperReal PreMix Plus采用了独特的双组分热启动DNA聚合酶(化学修饰的HotStar Taq
DNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶),配合精心优化buffer体系,具有高扩增效率,高扩增特异性和宽广的可信范围的特点。本升级版试剂在经过成分调整后,扩增特异性上的优势更为突出。
1. SuperReal PreMix Plus采用了独特的双组分热启动DNA聚合酶(化学修饰的HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶),从而构成酶活自动调节系统,配合精心优化buffer体系,具有高扩增效率,高扩增特异性和宽广的可信范围的特点。
2. 本产品Buffer体系平衡了K+和NH +的比例,还特别添加了独特的H-Bond因子, 能协同调整反应体系中的氢键作用力,使引物模板退火条件更加严谨,反应的专一性增强,重复性更好。
3. SuperReal PreMix Plus中预混有SYBR Green I,PCR反应液配制时,只需加入模板、引物、灭菌蒸馏水便可进行Real Time PCR反应,操作简单方便。
4. 本产品附带ROX Reference Dye,用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差,方便客户针对不同型号荧光定量PCR仪时选择对应浓度使用。
本产品采用了独特的双组分热启动DNA聚合酶进行PCR扩增,通过检测反应进程中
SYBR Green I的荧光强度,达到检测PCR产物扩增量的目的。
本产品中双热启动酶构成了独特的酶活自动调节系统。酶活自动调节系统是由化学修饰的HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶组成。其中HotStar Taq DNA 聚合酶占绝大部分比例,其聚合酶活性的激活是严格依赖于95℃高温的一个缓释过程,而Anti Taq DNA聚合酶则在95℃高温下完全激活。经过95℃条件下孵育15 min激活大部分HotStarTaq DNA聚合酶,进入PCR循环后,每经过一轮95℃条件下变性,即可重新激活一部分HotStar Taq DNA聚合酶。HotStar Taq DNA聚合酶独特的酶活缓释机制使其可以与Anti Taq DNA聚合酶构成独特的酶活自动调节系统。PCR反应初期,完全激活的Anti Taq DNA聚合酶可以协同已经激活的HotStar Taq DNA聚合酶达到优化酶活状态,而在整个PCR反应过程中,每一轮新释放的HotStart Taq DNA聚合酶活力刚好可以弥补因热变性所导致的部分酶活损失。因此,SuperReal PreMix Plus在整个PCR反应过程始终保持优化的DNA聚合酶活力,配合精心优化Buffer体系,从而可以获得高扩增效率,高扩增特异性和更加广泛性的模板适应性。
1. PCR反应的预变性条件必须设定为95℃ 15 min,用以充分激活热启动酶。
2. 本产品中含有荧光染料SYBR Green I,保存本产品或配制PCR反应液时应避免强光照射。
3. 如果试剂没有混匀,其反应性能会有所下降。使用时请上下颠倒轻轻混匀,请不要使用振荡器进行混匀,尽量避免出现泡沫,并经瞬时离心后使用。
4. 引物纯度对反应特异性影响很大,建议使用PAGE级别以上纯化的引物。
5. 引物终浓度为0.3 μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。如果需要进一步优化, 可以在 0.2-0.5 μM范围内调整引物浓度。
μl反应体系中,基因组DNA或cDNA模板的使用量一般小于100 ng,逆转录产物作为模板时,使用量应不超过PCR体系终体积的20%。
进行Real Time PCR反应时,PCR引物的设计非常重要。设计PCR扩增效率高,反应特异性强的引物可以参考以下要求
引物长度 | 18-30个碱基 |
GC含量 | 40-60% |
Tm值 | 引物软件都可以给出Tm,与引物长度,碱基组成,引物使用缓冲的离子强度也有关。 上下游引物的Tm值要尽量接近。 简单的Tm计算公式为:Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)。一般采用较引物Tm值低5℃作为PCR退火温度。 提高退火温度可以增加PCR反应的特异性。 |
引物及PCR扩增产物序列 | PCR扩增产物适宜长度在80-200 bp之间。尽量避开在模板的二级结构区域设计引物。 避免上下游引物3′端之间形成2个或以上的互补碱基以减少引物二聚体的形成。 引物3'端碱基不能有多于3个连续的G或C。 引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构。 避免引物3'末端碱基为T。 引物序列中A、T、G、C要尽量均匀分布。 |
1.无扩增信号或扩增曲线起峰晚或仅有引物二聚体
原因 | 解决办法 |
DNA模板中存在抑制剂 | 重新纯化模板或降低模板使用量 |
Mg2+浓度不合适 | 使用2×SuperReal PreMix Plus时,PCR反应体系中Mg2+ 的终浓度为2 mM。对有些扩增体系,可以将Mg2+终浓度提高到5 mM。进行Mg2+终浓度优化时,建议每次增加0.5 mM Mg2+浓度进行实验。 |
加样错误或试剂问题 | 检查试剂浓度和保存条件,包括所使用的引物和模板。重复 进行实验。 |
热启动酶未能激活 | 使用试剂时,请确保预变性条件为95℃ 15 min,用以有效激活热启动DNA聚合酶。 |
PCR 条件、引物序列或浓度不当 | 请确认引物未发生降解,引物浓度及PCR 条件,扩增不好时,通常先尝试降低退火温度,延长退火时间和提高引物浓度,有时也可以提高退火温度,增加延伸时间,降低升温 速度。对于GC 含量高的模板,可以适当延长变性时间。 如果还是扩增不好,请重新设计引物。 |
起始模板问题 | 检查起始模板的浓度,保存条件和质量。重新对模板进行线性梯度稀释,并用新稀释模板进行实验。增加起始模板使用量。 |