产品分类/PRODUCT CLASSIFICATION
pCMV-AT1.03 (ATP荧光探针)是自行研发的含有CMV启动子用于在哺乳动物细胞中表达AT1.03蛋白以作为ATP荧光探针的工具质粒。本质粒表达的ATP荧光探针被称为ATeam，即基于FoF1-ATP合成酶ε亚基的ATP指示剂(Adenosine 5'-Triphosphate indicator based on Epsilon subunit for Analytical Measurements)。AT1.03是一种低亲和力的ATeam (Kd=3.3mM at 37℃)，可以检测毫摩尔级的ATP水平。pCMV-AT1.03质粒在转染哺乳动物细胞后，AT1.03蛋白主要分布在细胞质中，适合用于实时监控细胞质内的ATP浓度变化。
AT1.03蛋白是以荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)为基础的实时监测单个活细胞内的ATP水平及其实时变化的ATP荧光探针。该荧光探针由N端的青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein) mseCFPΔC11 (激发光波长435nm，发射光波长475nm)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的FoF1-ATP合成酶的ε亚基以及C端的黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein) cp173-mVenus (激发光波长515nm，发射光波长527nm)融合而成(参考图1)。枯草芽孢杆菌的FoF1-ATP合成酶的ε亚基是几乎最小的ATP结合蛋白(14kDa)，它由一个N端β桶状结构域和两个C端α螺旋结构域组成。作为基于FRET的ATP荧光探针，FoF1-ATP合成酶的ε亚基具有几个突出优点：ε亚基与ATP结合，但不水解ATP；结合ATP，但不结合ADP、GTP、CTP以及UTP；当ATP结合时，ε亚基发生很大的构象变化形成一个折叠的构象(folded form)，从而使N端的青色荧光蛋白以及C端的黄色荧光蛋白得以在空间上接近，而发生荧光共振能量转移(激发光波长435nm，发射光波长527nm)。
图1.AT1.03蛋白结构图。
pCMV-AT1.03质粒转染Hela细胞后的ATP荧光探针表达效果请参考图2。
图2.pCMV-AT1.03质粒转染Hela细胞后的ATP荧光探针表达效果图。A图为明场照片，B图为荧光照片。
AT1.03的荧光信号在pH7.1-8.5之间非常稳定，这样AT1.03的荧光信号在正常细胞质内(pH7.3左右)几乎不会发生波动。ATP的结合常数Kon为1.7×10-2mM-1s-1，ATP的解离常数Koff为9.8×10-2s-1，因此AT1.03可用于监控细胞内高达0.1s-1 ATP的动态变化，特别适合用于实时监测超短时间内的ATP浓度变化。
pCMV-AT1.03 (ATP荧光探针)为卡那霉素抗性，转染细胞后，可使用G418筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。
pCMV-AT1.03质粒的主要信息如下：
| Feature Nucleotide | Position |
| CMV promoter | 1–602 |
| T3 promoter and T3 primer binding site | 620–639 |
| AT1.03 | 699-2534 |
| multiple cloning site | 651-692/2535-2558 |
| T7 promoter and T7 primer binding site | 2581–2629 |
| SV40 polyA signal | 2641–3024 |
| f1 origin of ss-DNA replication | 3162–3466 |
| bla promoter | 3491–3615 |
| SV40 promoter | 3635–3973 |
| neomycin/kanamycin resistance ORF | 4008–4799 |
| HSV-thymidine kinase (TK) polyA signal | 4800–5258 |
| pUC origin | 5387–6054 |
pCMV-AT1.03质粒(6106bp)的图谱如下：
pCMV-AT1.03中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pCMV-AT1.03)包括：
| AclI | AfeI | AflII | AgeI | AhdI | AscI | AsiSI |
| BaeI | BbsI | BbvCI | BlpI | BsiWI | BsmBI | BspEI |
| BspQI | BssHII | BstEII | BstZ17I | EarI | EcoNI | Esp3I |
| FseI | HindIII | NruI | PflMI | PmeI | PmlI | PpuMI |
| PshAI | PspXI | SalI | SapI | SbfI | ScaI | SgrAI |
| SwaI | XcmI | XmnI |
pCMV-AT1.03中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pCMV-AT1.03)包括：
| AccI | GT`MK,AC | 1432 | NarI | GG`CG,CC | 4136 |
| ApaLI | G`TGCA,C | 5740 | NdeI | CA`TA,TG | 240 |
| BamHI | G`GATC,C | 687 | NheI | G`CTAG,C | 597 |
| BclI | T`GATC,A | 2795 | NotI | GC`GGCC,GC | 672 |
| BglII | A`GATC,T | 2535 | PaeR7I | C`TCGA,G | 2541 |
| BmgBI | CAC|GTC | 1772 | PciI | A`CATG,T | 6054 |
| BmtI | G,CTAG`C | 597 | PflFI | GACN`N,NGTC | 4254 |
| BsaI | GGTCTCN`NNNN, | 5125 | PluTI | G,GCGC`C | 4135 |
| BsaXI | ,NNN`(N)9AC(N)5CTCC(N)7,NNN` | 3185 | PvuI | CG,AT`CG | 2639 |
| BsrDI | GCAATG,NN` | 4367 | RsrII | CG`GWC,CG | 4652 |
| BsrGI | T`GTAC,A | 1990 | SacI | G,AGCT`C | 651 |
| BstBI | TT`CG,AA | 4818 | SacII | CC,GC`GG | 660 |
| BstXI | CCAN,NNNN`NTGG | 663 | SfiI | GGCCN,NNN`NGGCC | 3908 |
| CspCI | ,NN`(N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN` | 380 | SfoI | GGC|GCC | 4137 |
| DraIII | CAC,NNN`GTG | 3251 | SmaI | CCC|GGG | 682 |
| Eco53kI | GAG|CTC | 653 | SnaBI | TAC|GTA | 346 |
| EcoRI | G`AATT,C | 1791 | SpeI | A`CTAG,T | 2553 |
| EcoRV | GAT|ATC | 1445 | SrfI | GCCC|GGGC | 682 |
| HincII | GTY|RAC | 2901 | StuI | AGG|CCT | 3957 |
| HpaI | GTT|AAC | 2901 | TspMI | C`CCGG,G | 680 |
| KasI | G`GCGC,C | 4135 | Tth111I | GACN`N,NGTC | 4254 |
| MfeI | C`AATT,G | 2888 | XbaI | T`CTAG,A | 2547 |
| MluI | A`CGCG,T | 3024 | XhoI | C`TCGA,G | 2541 |
| MscI | TGG|CCA | 4218 | XmaI | C`CCGG,G | 680 |
如需对pCMV-AT1.03质粒中插入片段AT1.03进行测序时，推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物T7的序列如下：
T3 primer (620-639): 5' AATTAACCCTCACTAAAGGG 3'
T7 primer (2581–2629): 5' GTAATACGACTCACTATAGGGC 3'
包装清单：
| 产品规格 | 产品名称 | 包装 |
| 1μg | pCMV-AT1.03 (ATP荧光探针) | 1μg |
| 100μg | pCMV-AT1.03 (ATP荧光探针) | 100μg |
| － | 说明书 | 1份 |
保存条件：
-20℃保存。
注意事项：
本质粒未经书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：
1.首次使用1µg包装的本产品时，请先取少量本质粒转化大肠杆菌，进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定，或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl，共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
