产品分类/PRODUCT CLASSIFICATION
烟曲霉(Aspergillus fumigatus.)属壳霉目、杯霉科、烟曲霉属，是一种重 要的致病菌，也是引起食品腐败的一种真菌。烟曲霉的菌落生长迅速，绒状或作 一定的絮状，暗烟绿色，老后色变得更深。此菌嗜高温，在 45℃或更高的温度下 生长茂盛。在粮食发热霉变的中期和后期常大量出现，促进粮温的升高和败坏。 烟曲霉能寄生在人、鸟类及其它脊椎动物的肺部引起结核症。也能侵染棉铃和苹 果等，引起果实腐烂，或寄藏于种子上。因此快速检测烟曲霉具有重要意义。本 产品就是以探针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测烟曲霉的试剂盒，它 具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物和探针经过优化，灵敏性高。
3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.特异性高，引物是根据烟曲霉的高度保守区设计，不会跟其他微生物DNA发生交叉反应。
5.本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
本产品只能用于科研。
| 成分 | 编号 | 五孔盒包装 |
| 2×Probe qPCR MagicMix | 190303 | 500μL（本色盖） |
| 荧光PCR专用模板稀释液 | 180701 | 1mL（红盖） |
| 超纯水 | 100935 | 1mL（紫盖） |
| 烟曲霉探针法qPCR 引物-探针混合液 | yp15-26720 | 150μL（棕色管） |
| 烟曲霉PCR阳性对照 (1×10E7拷贝/μL) | pc26720 | 50μL（黄盖） |
一、稀释标准曲线样品（以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
1. 标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3. 在6号管中加入5μL 1×10E7拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在5号管中加入5μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在4号管中加入5μL 1×10E5拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品DNA的制备
7. 如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL 第4号稀释液（第6步所得）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为样本制备PC。另外用水作为样本制备NC。
8. 用自选方法纯化样品的DNA，本扩增试剂盒跟市场上大多数细菌DNA提取试剂盒兼容。也可以使用本公司的免提取的核酸释放剂。
三、Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（可直接用第6步所得的第4号稀释液）。下面只以定量分析为例描述操作步骤
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
| 成分 | 样品管 N+2个 | PCR阴性对照管 | 标准曲线样品管 （1-6管） |
| 2×Probe qPCR MagicMix | 10μL | 10μL | 各10μL |
| 烟曲霉探针法qPCR引物-探针混合液 | 3μL | 3μL | 各3μL |
| N+2个待测DNA模板 | 7μL | 不加 | 不加 |
| 超纯水 | 不加 | 7μL | 不加 |
| 第6步所得标准曲线样品稀释液（1-6号） | 不加 | 不加 | 各7μL（1号样到1号管，2号样到2号管…） |
11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
| 过程 | 温度 | 时间 |
| 预变性 | 95℃ | 10 min |
| PCR反应 （45个循环） | 95℃ | 15sec |
| 55℃ 72℃ |
20sec 30sec（采集FAM通道的荧光信号） |
五、数据处理
1. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于38。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于38则为阳性。如果在38-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。
