产品分类/PRODUCT CLASSIFICATION
| 规格 | 价格 | 库存 |
|---|---|---|
| 10000 U | ￥ 680 | 200 |
1. 延伸性能好，可合成长达 12.5 Kb 的全长 cDNA。
2. 最佳反应温度为 42℃，但在 50℃时仍有活性，70℃10 分钟能使其失活。
3. 能 以 Cy3-，Cy5-，rhodamine-， aminoallyl-，fluorescein 等 标 记 的
4. 可用于 first strand cDNA 合成，second strand cDNA 合成，DNA labeling，RNA primer extension 等。
5. 与 PCR 兼容，RT 产物可以用于 PCR 和 Real-time PCR。
6. 能被金属螯合剂，无机磷酸，焦磷酸和多胺抑制。
没有 RNase H 活性。
| 成 份 | 编号 | 塑料袋包装 |
| MMLV 逆转录酶，200U/μL | 60905a | 50 μL（绿盖） |
| 5×RT Buffer | 60905b | 1 mL（本色盖） |
| 使用手册 | 60905sc | 1 份 |
| 运输及保存 | 低温运输，-20℃保存，有限期一年 | |||
| 使用方法 | 一：合成 PCR 用的 1st-strand cDNA 1. 按下表配制 RT 反应体系: | |||
|
|
| 成分 | 加入量 | |
|
|
| 自备 RNA 模板 |
| |
|
|
| 总 RNA | 100-500 ng | |
|
|
| 或 poly(A) mRNA | 10-500 ng | |
|
|
| 或专一的 RNA | 0.01pg-500ng | |
|
|
| 注意：RNA 样品不能有基因组 DNA 污染。 | ||
|
|
| 自备引物 |
| |
|
|
| Oligo (dT)18(0.5ug/μL) | 1 μL | |
|
|
| 或随机引物(0.2ug/μL) | 1 μL | |
|
|
| 或 RNA 模板专一性引物 | 15-20pmol | |
| | 注意：随机引物于 RNA 模板的比例跟最后得到的 cDNA 的平均长度成反比。 |
| |||
|
| 自 备 RNase-free 水 | 补水到 12 μL |
| ||
| 2. 70℃保温 5 分钟后立即冰浴。 3. 再严格按下表顺序加入各成分： 5×RT Buffer4 μL 自备 RNase Inhibitor (20U/μL)1 μL自备 dNTP (10 mM each)2 μL 4. 37℃保温 5 分钟。对富含二级结构的高 GC RNA 模板，可以改成 45℃保温 5 分钟。如果使用随机引物，则保温温度只能是 25℃（5 分钟）。 5. 加入 1 μL (=200 U) MMLV 逆转录酶，反应终体积为 20μL。 6. 42℃保温 60 分钟（但如果使用随机引物，需要先 25℃保温 10 分钟， 然后再转移到 42℃保温 60 分钟）。 7. 70℃保温 10 分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作为 PCR 模板使用，不需要纯化。 二：合成建文库用的 1st-strand cDNA 1. 按下表配制 RT 反应体系: 2. 70℃保温 5 分钟后立即冰浴。 3. 严格按下表顺序加入各成分： 4. 37℃保温 5 分钟。对富含二级结构的高 GC RNA 模板，可以改成 45℃保温 5 分钟。如果使用随机引物，则保温温度只能是 25℃（5 分钟）。 5. 加入 1 μL (=200 U) MMLV 逆转录酶，反应终体积为 20μL。 6. 42℃保温 60 分钟（但如果使用随机引物，需要先 25℃保温 10 分钟， 然后再转移到 42℃保温 60 分钟）。 7. 70℃保温 10 分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以
用于第二链 cDNA 的合成或放置在-20℃。 储存 Buffer：50 mM Tris-HCl (pH 8.3)，0.1 M NaCl，1 mM EDTA，5 mM DTT，0.1% (v/v) Triton X-100 和 50% (v/v) glycerol 。 反应 Buffer，5X：250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃)，250 mM KCl， 20 mM MgCl2，50 mM DTT。 活性定义 以 poly(rA)为模板，以 oligo(dT)12-18 为引物，在 37℃温度下，在 10 分钟将 1 nmol 的 dTMP 掺入到多核苷酸中所需酶量为一个单位。酶反应条件为: 50 mM Tris-HCl (pH 8.3)，6 mM MgCl2，10 mM DTT，40 mM KCl，
0.5 mM dTTP，0.4 MBq/mL [3H]-dTTP，0.4 mM polyA•oligo(dT)12-18 。纯度
| |||||
