长片段 PCR 扩增试剂盒
产品编号： B639285
包装规格： 50 rnx/ 100 rnx
试剂盒组成
组分 50 rnx 100 rnx
10X Long PCR Buffer 0.5 ml 1 ml
25 mM MgSO4 Solution 0.5 ml 1 ml
10 mM dNTP Mix 0.06 ml 0.12 ml
Dimethyl sulfoxide (DMSO) 0.25 ml 0.5 ml
Long and Accurate Enzyme, 5 U/µl 25 µl (125 U) 50 µl (250 U)
Sterilized ddH2O 1 ml 2 ml
操作手册 1 1
保存方法及稳定性
4°C 运输， -20°C 保存。避免反复冻融。
产品介绍
Long and Accurate PCR Kit 用于扩增大于或等于 5 kb 的片段。试剂盒中最重要的组分是 Long and Accurate Enzyme，
由 Taq DNA 酶和具有校对活性的热稳定 DNA 聚合酶组合而成。这种酶的主要特点包括两方面，一个是使用人类基因组 DNA
模板时产物可达 20 kb，使用病毒基因组模板时产物可达 40 kb；另一个是比 Taq DNA 聚合酶保真性高。Long PCR Buffer
可保护 DNA 在长期热循环中免受损伤。
10xLong PCR Buffer 含有 20 mM MgSO4，在反应体系中 MgSO4 终浓度为 2 mM MgSO4。如果需要更高浓度的 Mg2+，
请用 long and accurate PCR kit 提供的 25 mM MgSO4 溶液调整 Mg2+浓度。
标准操作步骤
1. 模板DNA
在 50 µl 反应体系中使用 1~10 ng 的质粒或噬菌体 DNA，或 0.1~1 µg 的基因组 DNA。高质量和完整的模板 DNA 是长
片段 PCR 扩增的关键。损伤的 DNA 可能会得不到目的 PCR 产物。基因组 DNA 可通过磁珠法 DNA 抽提试剂盒获得，无需
离心过程。另外，请将模板 DNA 分装成小分存储，避免反复冻融。降解的模板 DNA 不适合用来扩增长的目的片度。
2. 引物浓度
在一次 PCR 中引物的终浓度大约为 0.1~0.5 µM。PCR 产物小于或等于 10 kb 时，引物的终浓度为 0.1 µM。长片段的引
物设计原则和普通引物设计原则相似。主要不同在于引物应为 28~35 个核苷酸的长度。
3. 冰上溶解各组分并短暂离心。
4. 根据以下实验方案准备反应体系：
10X Long PCR Buffer 5 µl
10 mM dNTP Mix 1 µl
Forward primer 0.1~0.5 µM
Sangon Biotech
Reverse primer 0.1~0.5 µM
Template DNA 1 ng~1 µg
Long and Accurate Enzyme 1.25~2.5 U
Sterilized ddH2O 补足至 50 µl
注意：
如果 PCR 产物 GC 含量高，请加入 2 µl DMSO 到 50 µl PCR 反应体系中；
如果 PCR 产物大于 20 kb，dNTP Mix 终浓度是 0.3 mM；
请在最后加入 Long and Accurate Enzyme 并直接开始 PCR。
PCR 产物小于等于 15 kb，则 50 µl 使用 1.25 U long and accurate enzyme；PCR 产物大于>15 kb，每 50 µl 使用量最多为
2.5 U。
5. 将反应管放入离心机，离心30-60 s；
6. 若使用的热循环仪无热盖功能，则用矿物油将PCR混合液覆盖。
7. 样品放入PCR仪中，并根据以下循环程序直接开始PCR。
步骤 温度，°C 时间 循环数
预变性 94 2 min 1
变性 94 20 s
退火 Tm-5 30 s 10
延伸 68 1 min/kb
变性 94 20 s
退火 Tm 20~25 -5 30 s
延伸 68 1min/kb+X s/cycle
终延伸 68 10 min 1
保存 4 N.A. N.A.
根据下表计算延伸时间：
PCR 片段长度，kb 10 15 20 25 30 35 40
延伸时间，min 8 15 20 20 23 25 27
每个循环需要增加的时间，X s/cycle 5 5 10 10 15 15 20
应用案例
1. 扩增Enterobacteriaλ噬菌体基因组DNA区域(20kb)
2. 根据以下实验方案准备反应体系：
10xLong PCR Buffer 5 µl
dNTP Mix (10 mM) 1 µl
Lambda 20kF (10 µM) 0.5 µl
Lambda 20kR (10 µM) 0.5 µl
Lambda DNA (2 ng/µl) 0.5 µl
Long and Accurate Enzyme 0.25 µl
Sangon Biotech
Sterilized ddH2O 补足至 50 µl
3. 将反应管放入离心机并离心30–60 s。
4. 将样品放入循环仪中并根据下列循环程序直接开始PCR。
步骤 温度°C 时间 循环次数
Initial Denaturation 94 2 min 1
Denaturation 94 20 s
Annealing 63 30 s 10
Extension 68 20 min
Denaturation 94 20 s
Annea 20 ling 63 30 s
Extension 68 20 min+10 s/cycle
Final Extension 68 10 min 1
Hold 4 N.A. N.A.
5. PCR 产物通过0.5%琼脂糖凝胶电泳显示（图1）
M: Marker SM0101;
1: lambda 20kb
图 1 20kb PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳
常见问题指南
可能原因 意见& 建议
产物少或没有
模板 DNA 不足 根据标准操作步骤提高 PCR 中模板 DNA 的含量。
模板质量差
始终使用纯化、完整的高质量 DNA 作为模板。用琼脂糖凝胶电泳分析模板的
完整性。将模板 DNA 分装储存，避免反复冻融。
困难模板
如果模板 DNA 的 GC 含量高，反应体系中加入 4% DMSO 将有助于反应。此
外，每 50 μl PCR 反应体系中建议使用高达 2.5 U 的酶浓度。
热循环相关问题 检查是否正确设置了热循环程序，以 5 个循环数为增量提高循环次数。
Sangon Biotech
可能原因 意见& 建议
引物浓度过低 使用引物终浓度为 0.1~0.5 μM。
Mg2+浓度不是最优 优化并调整 Mg2+浓度。
产物多条带
引物设计不完善 检查引物设计及其特异性。
引物降解 检查引物溶液浓度和质量。
退火温度过低 提高退火温度。进行梯度 PCR，找到最优的退火温度。
循环数太多 减少循环次数以排除非特异性产物。
模板太多
扩增病毒或质粒 DNA 时，每 50 μl PCR 体系的初始模板浓度不应超过 10 ng；
扩增基因组 DNA 时，每 50 μl PCR 体系的初始模板浓度不应超过 1 μg。
产物被污染
起始模板太多 减少模板 DNA 的量。
循环数太多 以 5 个循环数为增量减少循环次数
延伸时间过长 以 2 分钟为增量减少延伸时间
Mg2+ 浓度不是最优 优化并调整 Mg2+浓度
酶过量 确保每 50 μl PCR 体系中加入的酶含量等于或少于 2.5 U。
携带污染 纯化 DNA 模板。使用尿嘧啶 DNA 糖基化酶以防止携带污染。
