pUCm-T 载体 & PCR 产物克隆试剂盒
产品编号： B620433_B620435
包装规格： B620433, 20 次/100 次； B620435, 20 次/100 次
试剂盒组成
组分
B620433
20 次
B620433
100 次
B620435
20 次
B620435
100 次
pUCm-T vector 1 µg 5 µg 1 µg 5 µg
10¥Ligation Buffer 50 µl 200 µl
50% PEG4000 50 µl 200 µl
T4 DNA Ligase, 5U/µl 100 U 500 U
Sterilized ddH2O 1 ml 1 ml
产品介绍
T-载体 PCR 产物克隆试剂盒适用于克隆带有 3’ 末端 A 突出的的 PCR 产物。本试剂盒提供的独特连接系统允许用户在
1~2 小时内的时间里完成连接反应。
本公司的 pUCm-T 载体是为简化 PCR 产物的克隆而设计的。许多热稳定的 DNA 聚合酶，如 Taq DNA 聚合酶、Tth DNA
聚合酶等扩增的 PCR 产物在 3’末端后都带有一个突出的碱基 A，这样的 PCR 产物很容易连接到带有突出碱基 T的 T载体上。
Sangon 生产的 pUCm-T 是一种新颖的 pUC 系列 T 载体，其多克隆位点大多是单切点，以及 β-半乳糖苷酶读码框的调
整，大大方便了克隆的蓝/白筛选。插入位点两端独特设计的两个 PstI 位点使插入片段可以用 Pst I 单酶切进行检测，也可以
用非常廉价而高效的 EcoR I 和 Hind III 双酶切进行检测。可以用 M13 通用引物和 T7 启动子引物对 PCR 产物进行测序。
pUCm-T 含有 T7 RNA 聚合酶的启动子，可以对插入片段进行体外转录。
本文末列出了 pUCm-T 相关的技术资料，其全序列可参照 pUC19（GenBank Accession Number M77789），只是其多
克隆位点部分的序列有所不同。
连接反应的准备
PCR 产物是否需要纯化取决于扩增产物的质量。如果 PCR 产物特异性很高，则不需要对产物进行纯化。但是如果将质
粒作为模板，则需要对 PCR 产物进行纯化，因为质粒模板在转化后会形成白色的菌落。PCR 产物可通过琼脂糖凝胶电泳进
行分离。本公司的 PCR 产物胶回收试剂盒(B610353) 可有效回收>60 bp 的 DNA 片段。
Taq、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNA 聚合酶扩增的 PCR 产物会在 3’末端添加碱基 A。Taq DNA 聚合酶同具有 3’Æ5’ 外
切酶活性的 Pfu、Pwo、Tli 或 Deep vent DNA 聚合酶共同扩增的产物也可能会在 3’末端添加碱基 A。PCR 产物 3’端含有突
出的碱基 A 可以被连接到 pUCm-T 上。具有 3’Æ5’ 外切酶活性的 DNA 聚合酶扩增的 PCR 产物为平末端，克隆这样的片段
需要在平末端加 A。
本公司的 A-Tailing Kit（B620513）可有效地在 3’末端添加碱基 A。
连接反应
1. 在一个标准的10 µl连接反应体系中，加入50ng (1 µl) pUCm-T vector、0.2 pmol PCR产物、1 µl 10¥ligation Buffer 和1
µl T4 DNA Ligase, 并加入ddH2O至终体积为10 µl，通常不需要对PCR产物进行定量。连接反应体系可根据如下进行配
制：
1 µl 10¥Ligation Buffer
1 µl 50%PEG
Sangon Biotech
1 µl pUCm-T vector
X µl 纯化的 PCR 产物
Y µl Sterilized water
1 µl T4 DNA Ligase
10 µl (Final Volume)
注意： T4 DNA Ligase 最后加。
2. 16~23°C连接1 h~过夜。
注意：常规实验 1 h 已足够。
转化
推荐使用本公司的 Competent Cell Preparation Kit (B620523 或 B620525)
1. 将100 µl 感受态细胞冰上解冻，完全溶解后轻轻混匀 。
2. 加入5 µl上述连接液，轻轻混匀，冰上放置30 min。
3. 42°C 水浴热激1.5 min。再在冰上放置 2~10 min。
4. 加入400 µl LB 培养基，37°C 200~250 rpm振荡培养1 h。
5. 4000 rpm离心5min，用枪头吸掉400 µl上清液，用剩余的培养基将细胞重悬。
6. 将细菌悬液均匀涂布在含有20 μl IPTG（100 mM）和100 μl X-gal（20 mg/ml）的氨苄青霉素抗性的LB平板上。
注意：使用细菌的数量取决于连接和转化的效率。
7. 将平板在37°C正向放置 1 小时后吸掉过多的液体， 倒置培养过夜。
筛选
通过蓝/白斑筛选转化子
当外来 DNA 片段被克隆进 pUCm-T时，LacZ 基因读码框的编码序列被插入的外来 DNA 改变，因此a-序列的活性被影响，，
重组克隆可在 X-gal/IPTG 平板上通过颜色进行筛选，未发生重组克隆的菌落为蓝色。用牙签挑选 IPTG/X-gal 平板上的白色
菌落，转移到含 Amp+的液体培养基 37°C 过夜培养。
转化子的鉴定
1. 从含白色菌落的液体培养基中提取质粒，用PstI 或其它合适的限制性内切酶酶切质粒，检测插入片段的大小，以证明该
菌落是否含有目的片段。
2. 克隆的目的片段可使用M13通用引物或其它合适的引物进行测序，进一步证明该菌落含有目的片段。
附录
1. A. pUCm-T载体图谱 Sangon Biotech
2. UCm-T载体启动子和多克隆位点序列
M13/pUC Sequencing Primer(-20) EcoR I Sac I Kpn I T7 Transcription Start Nde I
T7 Promoter
5’-G TTG TAA AAC GAC GGC CAG TGA ATT CGA GCT CGG TAC CGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCG ACA TAT
GAT
3’-C AAC ATT TTG CTG CCG GTC ACT TAA GCT CGA GCC ATG GCA TTA TGC TGA GTG ATA TCC CGC TGT ATA CTA
A
PCR Products
Cla I EcoR V Nco I Not I Pst I A Bgl II BamH I Xho I
CGA TGA TAT CCC ATG GGC GGC CGC CTG CAG ACC AGG TCT AGA CTG GAG ATC TGG ATC CCT CGA
GTC
GCT ACT ATA GGG TAC CCG CCG GCG GAC GTC TGG TCC AG T TCT GAC CTC TAG ACC TAG GGA GCT CAG
Xba I Sal I Pst I Pae I Hind III
TAG AGT CGA CCT GCA GGC ATG CAA GCT TGG CGT AAT CAT GGT CAT AGC TGT TTC CTG -3’
ATC TCA GCT GGA CGT CCG TAC GTT CGA ACC GCA TTA GTA CCA GTA TCG ACA AAG GAC -5’
Lac Z
M13/pUC Reverse Primer (-26)
Sangon Biotech
3. pUCm-T载体的酶切位点
a. 不切割 pUCm-T 载体的限制性内切酶
AcaI,AccIII,AceII,Afa24RI,AgeI,AmaI,AosIII,ApaI,ApeI,AscI,Asp78I,AtuCI,AvaIII,AvrII,BaeI,BalI,Bbf7411I,BbsI,BclI,Bco102I
I,BfrBI,BlpI,BmgI,BplI,Bpu10I,Bpu1268I,BsaAI,BsaFI,BsaKI,BsaMI,BscEI,BscJI,Bse59I,BseRI,BsgI,BsiWI,BsmFI,BsmGI,B
sp120I,Bsp87I,BspGI,BspLU11III,BsrGI,BssHII,Bst1107I,Bst29I,Bst98I,BstEII,BstXI,Bsu36I,CfrAI,CspI,Csp45I,DraIII,DrdII,
EciAI,EciEI,Eco47III,Eco72I,EcoAI,EcoBI,EcoDI,EcoDXXI,EcoDR3,EcoEI,EcoNI,EcoR124I,EcoR124II,EcoRD3,FinI,FseI,
HpaI,MluI,Mlu1106I,Mlu113I,Msp20I,MunI,NaeI,NgoMI,NheI,NruI,NsiI,PacI,PauI,PfuI,PmeI,Ppu10I,Ppu6I,PpuMI,PshAI,Rle
AI,SacII,SanDI,SfiI,SgfI,SgrAI,SmaI,SnaI,SnaBI,SpeI,SrfI,Sse8647I,StuI,StySQ,SwaI,Uba1220I,Uba1221I,Uba1382I,UbaD
I,Van91I,XmaI
b. 切割 pUCm-T 载体一次的限制性内切酶
497AacI,2708AatII,517AccI,408Acc65I,503AcrI,515Acs1371I,893AflIII,2263AflIV,503AhyAI,1309AlwNI,186ApaBI,396ApoI,
443Apu16I,533Asp52I,527Asp5HI,455AteI,504AvaI,498BamHI,406BanII,239BbeI,234BbeAI,534BbrI,2291BcgI,2325BcgI'
492Bco63I,492BglII,1852Bli49I,1847BsaI,756BsaXI,497BsaBI,117BsbI,449BshLI,462BsoDI,401Bsp117I,407BspJ106I,893
BspLU11I,529BspMI,455Bst224I,1866Cfr10I,515ChuII,445ClaI,456DsaI,515DsaVI,401Ecl137I,1786EclHKI,463Eco52I,39
5Eco82I,397EcoDR2,404EcoICRI,2443EcoKI,2762EcoO109I,396EcoRI,452EcoRV,541EcoprrI,237EheI,50Esp16I,45Esp3
I,474FsuI,518HincII,534HindIII,235KasI,412KpnI,236NarI,456NcoI,508Nli387/7I,463NotI,1801Pfl1108I,2703Ppu1253I,276
5PssI,406SacI,516SalI,777SapI,2266ScaI,506SciI,476SexAI,532SphI,526Sse8387I,2590SspI,456StyI,158StySJ,2443Sty
SPI,2380SynII,478Tth111I,1490Tth111II,2760Uba1326,510XbaI,484XcmI,504XhoI,2385XmnI.
Sangon Biotech
