产品分类/PRODUCT CLASSIFICATION
产品及特点
支原体和亲缘关系很近的无胆甾原体、螺旋体统称霉形体。霉形体是目前发现的最小的、最简单的原核生物。它们缺乏细胞壁、有变形能力、能通过滤菌器、 可在无生命培养基中生长繁殖，成为细胞培养中常见的一种污染源，严重影响细胞生长率、细胞形态、基因表达、细胞代谢和细胞活力。因此快速灵敏检测支原体具有重要意义。本产品就是为此目的根据 PCR 原理开发的试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。
2.引物和探针经过优化，灵敏性高。
3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.特异性高，引物是根据支原体高度保守区设计，不会跟其他微生物的 DNA 发生交叉反应。
5.本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。
6.本产品只能用于科研。
| 成份 | 编号 | 十孔盒包装 |
| PCR MagicMix 3.0 | 90805 | 1 mL（红盖） |
| 超纯水 | 100935 | 1 mL（亮黄盖） |
| 支原体通用 PCR 引物混合液 | 13-74000yw | 100 μL（白盖） |
| 支原体通用 PCR 阳性对照 （1×10E8 拷贝/μL） | 13-74000pc | 50 μL（黄盖） |
运输及保存：低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。
自备试剂：样品 DNA。
使用方法：
一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1.标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3.在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用
5.换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用
6.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。二、样品 DNA 的制备
7.如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为 NC。
8.用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的核酸释放剂，使用后其裂解液可以直接作为 PCR 模板，省略了 DNA 提取步骤。
三、Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
9.如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好
后最后加）：
| 成分 | N+2 个 样品管 | PCR 阴性 对照管 | PCR 阳性 对照管 |
| PCR MagicMix 3.0 | 各 20 μL | 20 μL | 20 μL |
| 支原体通用 PCR 引物混合液 | 各 2 μL | 2 μL | 2 μL |
| N+2 个样品 DNA 模板 | 各 18 μL | - | - |
| PCR 阴性对照（超纯水） | - | 18 μL | - |
| PCR 阳性对照（支原体通用 PCR 阳 性对照的 10000 倍稀释液） | - | - | 18 μL |
12.盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：
| 过程 | 温度 | 时间 |
| 预变性 | 95℃ | 5 min |
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PCR 反应 （35 个循环） | 95℃ | 30 sec |
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| 55℃ | 30 sec |
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| 72℃ | 60 sec |
| 最后延伸 | 72℃ | 10 min |
四、数据处理
12.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
13.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 34。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 34 则为阴性，如果小于或等于 30则为阳性。如果在 30-34之间，则重复一次。重复实验的 Ct值，如果大于或等于 34 则为阴性，如果小于 30，则为阳性。
