本产品是基因包涵体微量纯化试剂盒的大提升级产品， 用于大量，快速的提取高质量的包涵体。它具有下列特点：

1. 大量提取，1 次可处理多达 5 升的菌液，相当于 50 次中量提取。

2. 适合制备级别的包涵体纯化，需在 50 mL 以上的离心管或离心瓶中完成。

3. 能有效去除包涵体中的细胞壁和细胞膜等非重组蛋白成份，使重组蛋白在包涵体中所占比重达到 60%以上。

4. 即可以选择高压裂解法，也可以采用酶学裂解法裂解细菌。

得到的包涵体可以用于重折叠，也可以用于凝胶层析和动物免疫

运输及保存常温运输，4℃保存（溶菌酶需要-20℃保存，包涵体溶解液可以室温保存），有效

期一年。

自备试剂如果得到的重组蛋白确有降解则需要自备蛋白酶抑制剂混合物（CAT#：80808）

使用方法一．细胞沉淀：

1.转移 1-5 升菌液到干净的、预称重量的塑料离心瓶中。如果离心瓶体积不够大， 可以分多次反复离心收集。

2.5,000 g （相当于 Sorvall GSA 转头 5500 rpm） 4℃离心 15-30 分钟，小心弃上清。

3.复称重量，差值就是细菌的湿重。1 升的过夜培养的大肠杆菌湿重一般为 3 克， 所以 1-5 升菌液一般能得到 3-15 克细菌。注意：后续操作的很多溶液都是按此步得到得细胞湿重添加。

4.细胞沉淀可以立即使用或存放在-80℃待用。

二．细胞裂解(下面两法中选其一)：

高压破碎法（French Press）+超声法（推荐方法）

1.按每克细菌湿重加入 3 mL 溶液 A 重悬细胞，可以用玻璃棒搅拌或用 Waring捣碎机匀浆（如果细菌湿重超过 10 克）使细菌悬浮，直到检测不到成块的细

胞为止。如有必要，可以加入溶菌酶干粉，使其终浓度为 0.2mg/mL。

2.让细胞通过压力为 16000-18000 lb/in2 的高压细胞破碎仪，收集的细胞裂解液需放冰上。

3.重复上步操作一次或多次，直到绝大部分细菌都被裂解。注意：每次处理后最  好在显微镜下检查细菌裂解的比例。

4.将细胞裂解液置于冰浴中，用超声破碎仪满功率下超声处理 5 分钟，工作状态为 50%（开 0.5 秒，关 0.5 秒）。此过程中最好将细胞裂解液放冰上并用磁力搅拌器搅拌，否则产生的热量会使包涵体蛋白变性，在纯化中丢失。

酶法+超声法（在没有高压破碎仪器时首选方法）

1.按每克细菌湿重加入 3 mL 的含溶菌酶的溶液 A 重悬细胞，可以用玻璃棒搅拌细菌沉淀使之悬浮。

2.在细菌悬浮液中加入溶菌酶干粉，使其终浓度为 0.2mg/mL，搅拌混匀后 37℃放置 30 分钟裂解细菌，其间不时需要用玻璃棒混匀。细菌释放出的 DNA 将使裂解物变得十分粘稠。如果不粘稠，说明裂解不充分，需要继续裂解，否则  完整细菌将和包涵体一起沉淀，影响包涵体的纯度。由于处理量大，最好在显  微镜下检查细菌是否充分裂解。

3.将细胞裂解液置于冰浴中，用超声破碎仪满功率下超声处理 5 分钟，工作状态为 50%（开 0.5 秒，关 0.5 秒）。此过程中最好将细胞裂解液放冰上并用磁力搅拌器搅拌，否则产生的热量会使包涵体蛋白变性，在纯化中丢失。

三．包涵体纯化：

1.将超声处理的细胞裂解液转移到离心瓶中，22，000g 4℃下高速离心 60 分钟

（注意：转子不同其对应的离心速度不同），小心收集上清。上清含有以可溶形式存在的重组蛋白，可以保留作为 SDS-PAGE 对照样品。

2.将沉淀（主要由包涵体构成）悬浮在预冷的溶液 B 中。每克细菌需要 5 mL 溶液 B，1 升细菌的湿重约 3 克，大约需要 15 mL 溶液 B，用玻璃棒或匀浆器搅拌混匀后室温放置 5 分钟。

3.22，000g 4℃下高速离心 30 分钟，沉淀将出现三层，最下面的是未彻底破裂的细胞碎片，其上是包涵体，最上层的松软沉淀是细胞壁和细胞外膜。如果处  理过程中使用过溶菌酶，则此层较薄。小心收集上清，可以作为包涵体第一次  洗涤的对照样品。

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4.

重复第 8-第 9 步直到上清变清和最上层细胞壁和细胞外膜松软沉淀消失，此过程一般需要重复洗涤 2 次（共 3 次洗涤），小心收集上清作为包涵体第二次洗涤和第三次洗涤的对照样品。本试剂盒提供的溶液 B 足够一次 5 升规模的提取洗 3 次，如需更多溶液 B 请单独购买。

5.上步得到的沉淀即为包涵体，其中重组蛋白一般占 60%重量，其余 40%为其他蛋白质。此沉淀可以长期放置在-80℃冰箱待用，也可以直接用于免疫动物制备抗体，还可以直接进入下面得包涵体的溶解步骤。

6.估计重组蛋白的产率：首先需要通过预实验知道重组蛋白的表达水品，如果表  达水平为 1%，则 1 克湿重的细菌中将含有 1 mg 重组蛋白质。此法得到的重组蛋白质的回收率一般在 75%，即 1mg 重组蛋白质能得到 0.75 mg，丢失0.25mg。

四．包涵体的溶解：

1.在室温下，将包涵体溶解液加入到包涵体沉淀中，用枪头充分吹打后漩涡震荡。  如果需要将溶解的包涵体直接用于凝胶过滤层析进一步纯化，则按每克原始细胞湿重加入 1 mL 包涵体溶解液，重组蛋白的浓度约为 4-5 mg/mL；如果需要将溶解的包涵体直接用于蛋白质折叠，则按每克原始细胞湿重加入 3 mL 包涵体溶解液, 重组蛋白的浓度约为 1-2 mg/mL；注意：包涵体溶解液低温放置会产生沉淀，必须 45-65℃溶化并混匀后才能使用。

2.室温放置 1 小时使蛋白质充分溶解。

3.100,000g 4℃离心 60 分钟(转速需要根据离心机转子的大小换算)，小心收集上清，保留不溶性沉淀。注意：检查离心管能否承受此离心力。SDS-PAGE 检查是否大部分重组蛋白都在上清中。如果没有，说明包涵体没有完全溶解，  需要用适当增加包涵体溶解液的用量。

4.将上清（溶解的包涵体）分成 10-20mL 一份，放于塑料离心管中（不要超过离心管容量的 70%）置-80℃长期保存或直接用于复性等试验。由于不同的蛋白质有不同的最佳复性条件，需要用户自己摸索。包涵体纯化过程中引入了溶  菌酶，在 SDS-PAGE 分析时可能有额外条带出现。

包涵体微量提取试剂盒（CAT#：90508-50），包涵体中量提取试剂盒（CAT#： 90509-5）