产品分类/PRODUCT CLASSIFICATION
| 产品及特点 | 人类免疫缺陷病毒１型（HIV-１）患者血浆中病毒 RNA 水平一直以来是评判抗病毒治疗效果或预测疾病进展的重要指标。但是，经抗病毒治疗后血浆 HIV-１RNA 已达到基线水平感染者的血液、精液或淋巴结中仍可以检测到 HIV-１原病毒 DNA 的存在，构成病毒储藏库，对清除 HIV-１病毒构成严重阻碍。所以在病毒载量已经检测不到的情况下，HIV-１原病毒 DNA 水平可以作为除 CD4+Ｔ细胞计数和病毒载量之外的另一标志物。本公司开发 HIV-1 前病毒染料法荧光定量 PCR 试剂盒，它具有下列特点： 1. 即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。 2. 引物根据 HIV-1 前病毒专一区设计，特异性高。 3. 荧光定量PCR 检测，比常规 PCR 更加灵敏。 4. 一管式闭管操作，降低了交叉污染。 5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。 6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。 | ||||
| 规格及成分 |
| 成分 | 编号 | 十孔盒包装 |
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| 2×qPCR Magic Mix | 90408 | 500 μL（棕色管） | |||
| 荧光PCR 专用模板稀释液 | 180701 | 1 mL（黄盖） | |||
| HIV-1 前病毒染料法 qPCR 引 物混合液 | 14-22700yw | 100 μL（白盖） | |||
| HIV-1 前病毒染料法 qPCR 阳 性对照(1×10E8 拷贝/μL) | 60908-22700pc | 50 μL（黄盖） | |||
| 使用手册 | 14-22700sc | 1 份 | |||
| 运输及保存 | 低温运输、-20℃保存，有效期一年。 | ||||
| 自备试剂 | DNA 模板、超纯水、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。 | ||||
| 使用方法 | 一、稀释 PCR 阳性对照（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例） 1.注意：由于阳性对照浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。 2.标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。 3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液（最好用带芯枪头，下同）。 4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。 5. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。 6. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分 | ||||
震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。二、样品 DNA 的制备
8. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），
一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL PCR 阳性对照的 10000 倍稀释的（稀释后浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝，可以将 10μL 原液加入到 990μL 自备 TE 溶液中，充分混匀，此为 100 倍稀释液。再取 10μL 此稀释液加入到 990μL 自备 TE 溶液中，充分混匀，此为 10000 倍稀释液）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品 DNA。
9. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。
三、设置 qPCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）
10. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号阳性对照稀释液，浓度为 10E4 拷贝/μL）。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把 6 个标曲反应缩减成 1 个，其余不变。
11.
在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置注:仅ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene
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| 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，则用水替代。 12. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化）。 四、数据处理 13. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 cDNA 浓度的log 值，再推算出其浓度。 14. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 36。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 35 则为阴性，如果小于或等于 30 则为阳性。如果在 30-35 之间，则重复一次。若重复结果 Ct 值小于 35，扩增曲线有 明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。 |
| 关联产品 | HIV-1 前病毒探针法荧光定量 PCR 试剂盒 |
