注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

ACP 是一种在酸性环境下催化蛋白质水解的酶。该酶主要用于酒精发酵、啤酒酿造、毛皮软化、果酒澄清、酱油酿造、饲料等。

测定原理：

酸性条件下，ACP 催化酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝；钨蓝在 680nm 有特征吸收峰，通过测定其吸光度增加，来计算 ACP 活性。

自备仪器和样品：

可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、1.5 mL EP管和蒸馏水。

试剂组成和配置：

试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 10 mL 蒸馏水溶解。

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入 10 mL 试剂一，沸水浴溶解。

试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 50 mL 蒸馏水溶解。

试剂五：液体×1 瓶，4℃保存。

标准品：液体×1 支，0.25 μ mol/mL 标准酪氨酸溶液，4℃保存。

粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约0.1g组织，

加入1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心 10min，取上清，即粗酶液。

2. 血清或培养液：直接测定。

3. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500万细胞加入 1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

测定操作：

1.分光光度计预热30min，调节波长到680 nm，蒸馏水调零。

2.试剂二、试剂三和试剂四置于30℃水浴保温 30min。

3.对照管：取一支EP管，加入100μL粗酶液，200μL试剂二，混匀后置于30℃水浴保温10min；加入200μL试剂三，混匀后8000g， 4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入 1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为 A 对照管。

4.测定管：取一支EP管，加入100μL粗酶液，200μL试剂三，混匀后置于30℃水浴保温10min；加入200μL试剂二，混匀后8000g， 4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入 1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为 A 测定管。（注意与空白管不同，先加试剂三，后加试剂二）

5.空白管：取EP管，加入200μL蒸馏水，1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A空白管。

6.标准管：取EP管，加入200μL标准品，1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm 测定光吸收，记为A标准管。

注意：空白管和标准管只需要测定一次。

ACP 活性计算公式：

1. 按照蛋白浓度计算

ACP 活性单位定义：30℃每毫克蛋白每分钟催化水解产生1nmol 酪氨酸为1个酶活单位。

ACP 活性（nmol/min/mg prot）= C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×稀释倍数÷（Cpr×V1）÷T= 625×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷Cpr

C标准品：0.25 μmol/mL 标准酪氨酸溶液；稀释倍数：（100+200+200）÷200=2.5；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），注意该粗酶液不能直接用于蛋白质含量测定，需要另外测定；建议称取同样质量的样品，加入1mL 蒸馏水匀浆提取离心后，用本公司蛋白质含量测定试剂盒测定；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），100μL=0.1 mL；T：催化反应时间（min）,10min。

2．按照样本质量计算

ACP 活性单位定义：30℃每克样品每分钟催化水解产生 1 nmol 酪氨酸为1个酶活单位。

ACP 活性（nmol/min/g）=C 标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷（W×V1÷V2）÷T=625×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷W

C 标准品：0.25 μmol/mL 标准酪氨酸溶液；稀释倍数：（100+200+200）÷200=2.5；W：样品质量（g）；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），100μL=0.1 mL；V2：粗酶液总体积（mL），

1mL；T：催化反应时间（min），10min。

3. 按照液体体积计算

ACP 活性单位定义：30℃每毫升样品每分钟催化水解产生 1 nmol 酪氨酸为 1 个酶活单位。

ACP 活性（nmol/min /mL）=C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×稀释倍数÷V1÷T= 625×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）

C 标准品：0.25 μ mol/mL 标准酪氨酸溶液；稀释倍数：（100+200+200）÷200=2.5；V1：加入反应体系中血清或培养液体积，100μL=0.1 mL；T：催化反应时间，10min。

4. 按照细胞数量计算

ACP 活性单位定义：30℃每10⁴个细胞每分钟催化水解产生1 nmol 酪氨酸为1个酶活单位。

ACP 活性（nmol/min/10⁴cell）=C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×稀释倍数÷（细胞数量×V1÷V2）÷T = 625×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷细胞数量

C 标准品：0.25 μmol/mL 标准酪氨酸溶液；稀释倍数：（100+200+200）÷200=2.5；V1：加

入反应体系中粗酶液体积，100μL=0.1 mL；V2：粗酶液总体积，1mL；T：催化反应时间，10min。

注意事项：

临用前配制的试剂配置好后3天内使用完毕。