使用说明：

1. 样品的制备。

a. 选择合适的裂解液，用于制备细胞或组织的裂解液。优先推荐选择我司生产的P0013 Western及IP细胞裂解液用于细胞或组织样品的裂解。根据特定的实验目的，如有必要，也可以使用我司生产的P0013B RIPA裂解液(强)、P0013C RIPA 裂解液(中)或P0013D RIPA裂解液(弱)用于样品的制备。如果使用自行配制的或其它公司生产的裂解液，需要确保裂解液的pH为6-8。

b. 具体的细胞或组织样品裂解的制备步骤请参考裂解液的使用说明。制备好的裂解液上清宜置于冰上或4ºC存放，随后即可用于免疫沉淀或免疫共沉淀、标签蛋白的纯化等操作。新鲜制备好的样品，建议尽量当天完成免疫沉淀等后续操作， 但如果样品不能当天使用，也可以适当分装后-80ºC冻存。

2. Anti-Flag磁珠的准备。

由于Anti-Flag磁珠储存在特殊保护液中，所以需要在加入样品前适当洗涤。

a. 用移液器轻轻吹打重悬Anti-Flag磁珠，按照每500μl样品10μl或20μl磁珠悬浊液，取适量Anti-Flag磁珠至一洁净离心管中(FTUB015)，加入1X TBS (ST661/ST665)至最终体积为约0.5ml。说明：如果初始体积大于0.2ml，可以考虑先直接置于磁力架(FMS012/FMS024)上分离10秒，去除上清，然后再加入1X TBS (ST661/ST665)至最终体积为约0.5ml。

b. 用移液器轻轻吹打重悬Anti-Flag磁珠。置于磁力架(FMS012/FMS024)上分离10秒，去除上清。重复上述步骤两次。

c. 按照初始体积的量，用1X TBS (ST661/ST665)重悬Anti-Flag磁珠。

3. 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP):

a. 加入磁珠与孵育。按照每500μl蛋白样品加入10μl或20μl磁珠悬浊液的比例加入Anti-Flag磁珠，置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育2小时或4ºC孵育过夜。注：孵育过程中，如果磁珠发生聚团或呈片状属正常现象，不会影响实验结果。

b. 磁分离。孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，去除上清。注：可保留部分上清液，用于检测免疫沉淀的效果。

c. 洗涤。加入500μl的1X TBS，用移液器轻轻吹打重悬Anti-Flag磁珠。置于磁力架上分离10秒，去除上清。重复洗涤三次。注：也可以通过检测洗涤得到的洗涤液的OD₂₈₀来判断是否洗涤完全，若OD₂₈₀大于0.05，应适当增加洗涤次数。

4. 洗脱：

根据标签蛋白的特点及后续实验要求，可以选择如下3种方法之一进行洗脱。

a. 3X Flag竞争洗脱法：本方法为非变性法，洗脱效率高，且洗脱后的蛋白保持原有的生物活性，便于后续分析检测。

(a) 3X Flag多肽洗脱液的配制：取适量3X Flag多肽(P9801)溶解于1X TBS中，使其终浓度为150μg/ml，或稀释5mg/ml的3X Flag多肽溶液(P9801)至150μg/ml。

(b) 每10-20μl原始磁珠体积，加入100μl 3X Flag多肽洗脱液(150μg/ml)，混匀后置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温摇晃孵育30-60分钟，或4ºC孵育1-2小时。为了提高洗脱效率，可延长孵育时间或重复洗脱。

(c) 孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，将上清转移到新的离心管中。上清即为洗脱的Flag标签蛋白。

(d) 洗脱的Flag标签蛋白置于4ºC待用，或者-20ºC或-80ºC长期保存。

b. 酸性洗脱法：本方法为非变性法，比较快速且高效。洗脱后的蛋白保持原有的生物活性，便于后续分析检测。

(a) 溶液的配制：酸性洗脱液(0.1M Glycine-HCl, pH3.0)，中和液(0.5M Tris-HCl, pH7.4, 1.5M NaCl)。

(b) 每10-20μl原始磁珠体积，加入100μl酸性洗脱液，混匀后置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育5分钟。注：孵育时间不宜超过15分钟。

(c) 孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，将上清转移到新的离心管中，并立刻加入10μl中和液，适当混匀。

(d) 为了获得最大的洗脱效率，可重复步骤b和c，并将相同样品合并。

(e) 洗脱并中和的Flag标签蛋白置于4ºC待用，或者-20ºC或-80ºC长期保存。

注1：酸性洗脱法虽然高效，但仍可能低于竞争洗脱法或SDS-PAGE上样缓冲液洗脱法。

注2：由于目的蛋白的差异可能对酸性洗脱法的洗脱效率有一定的影响，如果对洗脱效率的要求比较高，可对酸性洗脱液的pH在2.5-3.1之间进行一定的调整，相应的中和液的pH值或量也要进行一定的调整，例如100μl酸性洗脱液(0.1M Glycine-HCl, pH2.8)和15μl中和液(1M Tris-HCl, pH8.5)。

保存条件：

4ºC保存，两年有效。长期不使用，可以-20ºC保存，-20ºC可以保存更长时间。

注意事项：

Ø 本产品经测试，反复冻融3次以上，不影响使用效果。

Ø 本产品需维持pH为6-8，避免高速离心、干燥或冻存；请勿长时间将磁珠置于磁场中，否则可能会引起磁珠聚团。