1. 0.1 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟,待其沥干水分,正置5分钟,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖,冰中静置5分钟充分降温。
2. 取-80℃保存的GT115电击感受态细胞插入冰中5 分钟,待其融化,加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀,避免产生气泡,立即插入冰中。 A. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒 pUC19; B. 对于连接产物,大部分公司的T4连接酶反应体系或50度反应重组体系可与GT115电击感受态混合后电击转化,无需进行DNA纯化,但DNA浓度不能过高,DNA浓度不超过100 ng/μl,体积不超过5 μl/50 μl感受态。 C. 对盐浓度较高的DNA溶液或反应体系请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬,然后与GT115电击感受态混合进行电击转化。
6. 5000 rpm离心一分钟收菌,重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的S.O.C平板上(因菌量较大,若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个)。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养13-17小时。 S.O.C 培养基配方 2% Tryptone 0.5% Yeast Extract 10 mM NaCl 2.5 mM KCl 10 mM MgCl2 10 mM MgSO4 20 mM glucose PH-7.0 S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983).