DH10B-Plus电击感受态细胞-上海雅吉生物科技有限公司

介绍：基因型F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) ϕ80lacZΔM15ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galE15 galK λ-rpsL nupG Hte(TetR)简要说明 DH10B-Plus电击感受态细胞只能用于电击转化，不能用于热激转化。DH10B-Plus菌株来源于DH10B菌株，在DH10B菌株中引入Hte突变，提高了细胞膜的通透性和对瞬时高压的耐受进而提高了电击转化效率。DH10B- Plus菌株适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA (无论真核生物还是原核生物的基因组DNA都能被高效的转入DH10B- Plus中)。recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取，ϕ80dlacZ ΔM15标记的存在使DH10B-Plus可用于蓝白斑筛选。DH10B-Plus电击感受态细胞具有链霉素和四环素抗性，适用于大质粒的构建或各种文库构建，经特殊工艺处理，pUC19质粒检测转化效率>2×1010 cfu/μg DNA。操作说明1. 0.1 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。2. 取-80℃保存的DH10B-Plus电击感受态细胞插入冰中5 分钟，待其融化，加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。
A. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒 pUC19；
B. 对于连接产物，大部分公司的T4连接酶反应体系或50度反应重组体系可与DH10B-Plus电击感受态混合后电击转化，无需进行DNA纯化，但DNA浓度不能过高，DNA浓度不超过100 ng/μl，体积不超过5 μl/50 μl感受态。
C. 对盐浓度较高的DNA溶液或反应体系请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬，然后与DH10B-Plus电击感受态混合进行电击转化。
3. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中，避免产生气泡，盖上杯盖。
4. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此为BioRad 电转仪推荐参数，也可按所用电转仪推荐的参数操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中。
5. 2分钟后从冰中取出电击杯，放室温，加入700 μl不含抗生素的无菌S.O.C. 培养基（室温），用1ml 枪吹吸电击杯底部数次混匀后，转移到50 ml离心管（BD Falcon 50 ml锥形离心管等），向离心管中补加S.O.C. 培养基至10 ml。37℃，225 rpm复苏60分钟。
6. 5000 rpm离心一分钟收菌，重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的S.O.C平板上（因菌量较大，若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个）。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养13-17小时。S.O.C 培养基配方2% Tryptone0.5% Yeast Extract10 mM NaCl2.5 mM KCl10 mM MgCl210 mM MgSO420 mM glucosePH-7.0S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtainmaximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983).
注意事项
1. 加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10，电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。
2. DH10B-Plus菌株有链霉素和四环素抗性，不可用于具有链霉素或四环素抗性质粒的转化。
3. 当DNA不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。
4. 电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。
5. 若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
6. 对于连接产物或文库转化，DNA浓度及盐离子浓度不可过高，保证DNA浓度不超过100 ng/μl。过高浓度连接产物或文库DNA会降低转化效率，盐离子浓度过高会增加弧光放电的风险。
7. 混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。8. 电击感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。

储存条件： -80℃

用途：克隆感受态细胞

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