一、反应原理
线粒体呼吸链复合物I通常称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶Q还原酶
（reduced nicotinamide adenine dinucleotide coenzyme Q reductase, NADH-CoQ
reductase），又称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶（reduced nicotinamide adenine
dinucleotide dehydrogenase；NADH dehydrogenase），是线粒体电子传递链中最大的结构
成分：含有30至40多个多肽结构。其特征性的酶活性是鱼藤酮敏感的NADH－辅酶Q还
原酶（NADH:Q Reductase）。复合物I催化线粒体内电子由供体NADH传递到内膜上辅酶
Q受体（泛醌；ubiquinone）的能量转移反应，为整个呼吸链反应系统的第一步。基于
辅酶Q底物，在鱼藤酮存在与否的情况下，通过NADH－辅酶Q还原酶的催化，转化成
还原型泛醌（CoQH2），同时还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine
dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine
dinucleotide；NAD），在分光光度仪下产生吸收峰值的变化（340nm 波长），由此定量
测定NADH－辅酶Q还原酶的特异活性。其反应系统是：
NADH:Q Reductase NADH + H
＋ + CoQ → NAD
－ + CoQH2 二、试剂组成：（20 管/10 样)）
缓冲液（Reagent A）
反应液（Reagent B）
阴性液（Reagent C）
底物液（Reagent D）
专性液（Reagent E）
产品说明书
20 毫升
2.5 毫升
2 毫升
500 微升
200 微升
1 份
三、保存方式
-20℃冰箱保存，避免反复冻融；反应液（Reagent B）含有毒性物质，避免直接用
手接触；反应液（Reagent B）和底物液（Reagent D），避免光照，有效保证6月
四、用户自备
比色皿：用于比色分析的容器
双波长分光光度仪：用于比色分析
培养箱：用于孵育反应物
五、实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；缓冲液
（Reagent A）室温预热；反应液（Reagent B）和底物液（Reagent D）注意避光。然
后进行下列操作。
（一）、背景对照测定
1、移取 780 微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2、加入 100 微升反应液（Reagent B）
3、加入 20 微升底物液（Reagent D）
4、放进 30℃培养箱里静置 3 分钟
5、加入 100 微升阴性液（Reagent C）
6、上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
7、即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：
（340 波长读数－380 波长读数）0 分钟－（340 波长读数－380 波长读数）1 分钟或 3 分钟
（二）、样品总活性测定
1、移取 780 微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2、加入 100 微升反应液（Reagent B）
3、加入 20 微升底物液（Reagent D）
4、放进 30℃培养箱里静置 3 分钟
5、加入 100 微升待测样品（注意：10 微克总线粒体蛋白）
6、上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
7、即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：
（340 波长读数－380 波长读数）0 分钟－（340 波长读数－380 波长读数）1 分钟或 3 分钟
（三）、样品非特异活性测定
1、移取 760 微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2、加入 100 微升反应液（Reagent B）
3、加入 20 微升专性液（Reagent E）
4、加入 20 微升底物液（Reagent D）
5、放进 30℃培养箱里静置 3 分钟
6、加入 100 微升待测样品（注意：10 微克总线粒体蛋白）
7、上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
8、即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：
（340 波长读数－380 波长读数）0 分钟－（340 波长读数－380 波长读数）1 分钟或 3 分钟
六、样品活性计算
（1） 、样品活性（总活性或非特异活性）
（样本读数 - 背景读数）×体系容量（1ml）×样本稀释倍数 样本蛋白浓度 ÷
样本容量（0.1ml）×5.5（毫摩尔吸光系数）×反应时间（1或者3分钟）
单位：μmol NADH/min/mgprot
（2） 、样品特异活性
样品总活性－样品非特异活性＝样品特异活性
（mgprot/ml）
（蛋白浓度可通过用 总蛋白定量考马斯亮蓝法试剂盒测定）
