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| 规格 | 价格 | 库存 |
|---|---|---|
| 50T/24样 | ￥ 1800 | 1 |
几丁质酶（Chitinase）试剂盒说明书
分光光度法 50T/24S
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
几丁质主要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官(例如乌贼的软骨)， 以及真菌类的细胞壁中。而几丁质酶(EC 3.2.1.14)可催化几丁质水解，具有抵御真菌侵染的 作用，成为抗真菌病害的研究热点。
测定原理：
几丁质酶水解几丁质产生 N-乙酰氨基葡萄糖，进一步与 DNS 试剂反应产生棕红色化合物， 在 540nm 处有特征吸收峰，吸光值增加速率反映了几丁质酶的活性。
自备实验用品及仪器
天平、水浴锅、离心机、分光光度计、1mL 玻璃比色皿、蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 12mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 30mL×1 瓶，4℃避光保存。
粗酶液提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃离心 20min，取上清，置冰上待测。
2. 真菌：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000 ：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒， 总时间 3min）；然后 10000g ，4℃, 离心 20min，取上清置于冰上待测。
3. 培养液：直接测定。
测定操作表：
|
| 对照管 | 测定管 |
| 粗酶液(µL） | 400 | 400 |
| 提取液(µL） | 600 | 200 |
| 试剂一 (µL） |
| 400 |
| 混匀，37℃水浴 1h 。沸水浴 5min 终止反应，冷却后 8000rpm ，4℃,离心 10min，取上清， 蒸馏水稀释 10 倍待用 | ||
| 上清 | 700 | 700 |
| 试剂二 (µL） | 500 | 500 |
| 混匀，95℃水浴 5min ，室温冷却。吸取 1000µL 至 1mL 玻璃比色皿，测定 540nm 下吸光值 A 测定与 A 对照，ΔA=A 测定-A 对照。 | ||
计算公式：
标准条件下测定回归方程为 y = 6.4108x - 0.2753 ，R2 = 0.9984；x 为标准品浓度（mg/mL）， y 为吸光值。
1 、 按照样本重量计算
酶活性定义：37℃条件下，每克组织每小时分解几丁质产生 1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量 为一个酶活性单位。
几丁质酶活性（mg/h/g 鲜重）= (ΔA+ 0.2753）÷6.4108×V 反总÷(V 样÷V 样总×W) ÷T×10
= 3.899× (ΔA+ 0.2753）÷W
2 、 按照蛋白质浓度计算
酶活定义：37℃条件下，每毫克蛋白每小时分解几丁质产生 1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量 为一个酶活单位。
几丁质酶活性（mg/h mg prot）= (ΔA+ 0.2753）÷6.4108×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T×10 = 3.899× (ΔA+ 0.2753）÷Cpr
3 、 按细胞数量计算
酶活定义：37℃条件下，每 104 个细胞每小时分解几丁质产生 1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量 为一个酶活单位。
几丁质酶活性（mg/h /104 cell）=(ΔA+ 0.2753）÷6.4108×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)×10 = 3.899× (ΔA+ 0.2753）÷细胞数量
4、按液体体积计算
酶活定义：37℃条件下，每毫升培养液每小时分解几丁质产生 1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶 量为一个酶活单位。
几丁质酶活性（mg/h /mL）= (ΔA+ 0.2753）÷6.4108×V 反总÷V 样×10
= 3.899× (ΔA+ 0.2753）
V 反总：反应体系总体积，1 mL；V 样：反应体系中样本体积，0.4mL；V 样总：加入提取 液体积，1mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；10 ，稀释倍数。
注意事项：
1 、 如果吸光值超过 4，说明样本中还原糖含量较高，需要额外稀释，并在最后结果中乘以 相应倍数。
