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96样	￥ 800	20

乙酰胆碱酯酶活性

规格：微量法 96样

检测原理：DTNB法

检测波长：412nm

注意：

1、正式测定前务必取 3 - 5 个预期差异较大的样本做预测定；

2、为了您的安全和健康，请佩戴好防护用具；

测定意义：

乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AchE）属于丝氨酸水解酶，广泛存在于各种动物组织和血清中。AchE催化乙酰胆碱（Ach）水解，在神经传导调节中起重要作用。

测定原理：

AchE催化硫代乙酰胆碱水解生成硫代胆碱和乙酸，硫代胆碱与巯基显色剂(二硫对硝基苯甲酸（DTNB）)作用生成5-巯基-硝基苯甲酸（TNB）；TNB在412nm处有吸收峰，通过测定412 nm吸光度增加速率，计算AchE活性。

自备仪器和用品：

酶标仪、96孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、冰和蒸馏水。

试剂清单：

试剂名称	规格	数目	贮藏
提取液	液体 100mL	x1	4℃
试剂一	液体 20mL	x1	4℃
试剂二	粉剂	x1	4℃,避光
试剂三	粉剂	x2	-20℃,避光

样品处理（按照步骤依次操作）：

一、组织样本

1、按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆；

2、然后8000g离心力 4℃离心10min，取上清置于冰上待测。

二、细菌、真菌样本

1、按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；

2、然后8000g离心力 4℃ 离心10min，取上清置于冰上待测。

三、液体样本

澄清样本可直接检测，若浑浊则离心取上清检测；

实验准备：

1、酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm；

2、试剂二的制备：临用前加入1.3mL试剂一，充分震荡溶解；

3、试剂三的制备：临用前取一支加入1.1mL试剂一，充分震荡溶解（现用现配，溶解后2h用完）；

测定操作：

1、取实验所需用量的试剂一于37℃预热；

2、在96孔板中依次操作

试剂名称（μL）	测定管
样本	20
试剂一	160
试剂二	10
试剂三	10
迅速混匀，于412nm处测定3min内吸光值变化，第10s吸光值记为A1，第190s吸光值记为A2。△A=A2-A1

注意：

1、加入试剂三后反应即会开始，注意控制时间；建议使用排枪操作以减小各孔时间差异；

2、若ΔA>2则样本酶活较高，建议将样本稀释后测定，以提高实验精确度，稀释倍数D代入公式计算；

3、若ΔA＜0，可尝试增加样本量后测定；或者适当调整样本加样体积（如40μL样本+140μL试剂一）测定，样本加样体积(V样)代入公式重新计算；

结果计算：

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷(Cpr×V样)÷T×D

= 490×△A÷Cpr×D

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：每克组织每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min/g 鲜重)= (△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷(W×V样÷V样总)÷T×D

= 490×△A÷W×D

（3）细菌、细胞AchE活性

活性单位定义：每10⁴个细胞每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min/10⁴ cell)= (△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷(细胞数量(万个)×V样÷V样总)÷T×D

= 490×△A÷细胞数量(万个)×D

（4）血清AchE活性

活性单位定义：每毫升血清每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min/mL)= (△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷V样÷T×D

= 490×△A×D

ε：TNB摩尔消光系数，13.6×10³L/mol/cm；

10⁹：1mol=1×10⁹nmol；

d：96孔板光径，0.5cm；

V样总：提取液体积，1mL；

V样：加入上清液体积（mL），0.02mL；

Cpr：蛋白浓度（mg/mL）；

W：样品质量；

T：反应时间（min），3min；

D：额外稀释倍数，未稀释即为1；

V反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10^-4L；

乙酰胆碱酯酶活性测试盒

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