产品分类/PRODUCT CLASSIFICATION
| 规格 | 价格 | 库存 |
|---|---|---|
| 50次 | ￥ 780 | 200 |
● 产品组成：
| 组分货号 | 名称 | 规格 | 贮存 | 运输 |
| PN5040-01 | 试剂1-NR诱导剂（50×） | 10 ml | 4℃ | RT |
| PN5040-02 | 试剂2-NR提取缓冲液（2×） | 25 ml | 4℃ | RT |
| PN5040-03 | 试剂3-NR分析缓冲液 | 25 ml | 4℃ | RT |
| PN5040-04 | 试剂4-NADH（10×） | 1.2 ml | -20℃ | RT |
| PN5040-05 | 试剂5-显色液1 | 15 ml | 4℃ | RT |
| PN5040-06 | 试剂6-显色液2 | 15 ml | 4℃ | RT |
| PN5040-07 | 试剂7-标准液（100×） | 1 ml | -20℃ | RT |
| DT0140P | 1M DTT | 1 ml | -20℃ | RT |
● 产品简介：
硝酸还原酶（Nitrate Reductase，NR，EC1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，它的活性高低直接影响到植物对土壤中硝态氮素的利用，影响作物的产量和品质。硝酸还原酶是一种诱导酶，通常在有 NO3-存在时，会诱导硝酸还原酶的活性。
测定原理：NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ+NADH→ NO2ˉ +NAD＋+H2O；产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对–氨基苯磺酸α-萘胺定量生成红色偶氮化合物； 生成的红色偶氮化合物在 540 nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
按照每次提取使用1 ml提取缓冲液计算，该产品可以使用45-50次。
● 贮存和效期：
试剂盒常温运输；按照标签温度贮存；开封使用后有效期一年。
● 自备材料：
植物根茎、叶子等；剪刀；离心管；分光光度计；水浴锅；离心机；1ml比色皿
● 操作步骤：
用前必读：由于不同材料NR活性差距较大，首次实验时建议取2-3个预期差异较大的样本做预测定。
准备30度水浴；分光光度计调节到540nm，开机预热30分钟。
一、 样本处理：
1. 样品的诱导前处理：
将NR诱导剂（50×）用蒸馏水稀释50倍，如取49 ml蒸馏水加入1 ml 诱导剂。 将植物样品浸泡于诱导剂中，浸泡2小时。
注：如未经诱导，植物体内NR活性很低，预测定结果没有活性(OD测定管＜OD对照管)则需要诱导处理。
二、 硝酸还原酶提取：
2. 即用型NR提取缓冲液配制：
|
| 一个反应配制体积 1 ml | n个反应配制体积 n×1 ml |
| 试剂2-NR提取缓冲液（2×） | 0.5 ml | n×0.5 ml |
| 1 M DTT（100×） | 10 μl | n×10 μl |
| 灭菌水 | 0.49 ml | n×0.49 ml |
注：配制好的即用型NR提取缓冲液可以4℃短期保存一周；
3. NR提取步骤
取诱导后的样品或新鲜植物组织，清洗干净，擦干，液氮中研磨，1 cm2叶片（1分硬币大小）或0.1g叶片粉末加入1 ml 即用型NR提取缓冲液，颠倒混匀， 12000rpm4℃离心 5分钟，上清即为NR提取液，冰浴放置备用。
注：NR提取液最好立即测定，不建议保存。
三、硝酸根还原步骤:
4. 即用型标准液配制：
取试剂7-标准液（100×）稀释100倍，即取10 μl加990μl灭菌水中，混匀，即用型标准液浓度为0.1 μmol/ml（100 μM）。
5. 即用型NADH配制：
根据标签所示加入超纯水配制试剂4-NADH（10×），稀释10倍，如取100 μl加900 μl灭菌水，混匀，冰浴备用。
6. 参考下表设置检测反应体系，按照顺序在1.5ml离心管中依次加入试剂（单位μl）：
| 加入顺序 |
| 1#测定管 | 2#对照管 | 3#标准管 | 4#空白管 |
| 1 | NR提取液（样本） | 100 | 100 | - | - |
| 2 | 即用型标准液 0.1 μmol/ml(100 μM) | - | - | 100 | - |
| 3 | 蒸馏水 | - | 125 | - | 125 |
| 4 | 试剂3-NR分析缓冲液 | 375 | 375 | 375 | 375 |
| 5 | 即用型NADH | 125 | - | 125 | - |
| 6 |
| 30度水浴0.5小时 | |||
| 7 | 试剂5-显色液1 | 250 | 250 | 250 | 250 |
| 8 | 试剂6-显色液2 | 250 | 250 | 250 | 250 |
| 9 |
| 混匀，常温显色0.5 小时 | |||
四、计算：
7. 用蒸馏水调零分光光度计，取1ml加到比色皿中，分别测定各管在540nm的吸光值，记录读数。
NR单位定义（Units）：每小时每克鲜重样品中催化产生1μmol NO2-的量为一个NR活力单位。
NR活性（μmol/h/g FW）=（测定OD-对照OD）/（标准OD-空白OD）×标准品浓度（0.1 μmol/ml）×（取样体积0.1 ml）/（样品鲜重g×反应时间0.5 h）×样品测定前稀释倍数（如0.1g叶片用1ml提取缓冲液，即稀释10倍）
此公式整理为：NR活性（μmol/h/g FW）=0.2/FW×（测定OD-对照OD）/（标准OD-空白OD）
8. 计算举例：
0.1克植物鲜重材料使用1 ml提取缓冲液提取：稀释倍数为10
测定OD=0.159 对照OD=0.121 标准OD=0.16 空白OD=0.004
NR 活性（μmol/h/g FW）=0.2/0.1×（0.159-0.121）/（0.16-0.004）=0.012
