产品分类/PRODUCT CLASSIFICATION
产品简介：
在非变性 PAGE 中，DNA 的迁移率除跟长短相关外，还跟其构象和结合的 蛋 白 质 相 关 ， 因 此 DNA 的 非 变 性 PAGE 电 泳 是 研 究 SSCP-PCR
（single-strand conformation polymorphism-PCR、单链 PCR 片段构象多态性）和凝胶滞阻（Gel Shift）的重要研究手段。本产品就是专门用于 DNA非变性 PAGE 的试剂
盒，它具有下列特点:
1. 一站式，用户只需要准备去离子水和样品，不需要单独优化各种条件，十分方便。
2. 安全，免去了实验人员接触粉末状的有毒物品丙烯酰胺。
3. PAGE 电泳后可直接用于银染等后续试验。
4. 可以用于 SSCP 和 Gel-Shift 实验。
5. 本产品足够 30 次 mini PAGE 凝胶电泳。
6. 本产品只能用于科研
下面的操作步骤是以 SSCP-PCR 的非变性 PAGE 电泳为例，其他应用请相应修改相关参数。
1. PAGE 浓度的选择：根据 SSCP-PCR 和 Gel-Shift 的 DNA 长度选择PAGE 凝胶的浓度。5%的 PAGE 的有效分辨范围为 80-500bp、8%的PAGE 的有效分辨范围为 60-400bp、12%的 PAGE 的有效分辨范围为40-200bp。
2. 体积的选择：SSCP-PCR 检测需要长约 30-40cm 的测序胶板，Gel-Shift实验一般只使用长度为 8-10cm 的 mini 凝胶，可以结合梳子的厚度，计算所需 PAGE 胶的体积。
3. 配制 PAGE 胶（下面以配制 100 mL PAGE 胶为例计算用量，配制更大体积的胶则需以此用量为基础按比例增加）：
A：新鲜配制 10%的 APS（过硫酸铵）：称量约 0.1 克硫酸铵干粉到一个1.5 mL EP 管中，按每 0.1 克过硫酸铵干粉加 1mL 自备去离子水的比例将水加到管中，摇晃到硫酸铵粉末全部溶解。配制好的 10%的APS 溶液可以在 4℃存放一周，超过一周不能再用。
B：新鲜配制 30%的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液（29:1）：将 2g 甲叉双丙烯酰胺倒入到装有 60g 丙烯酰胺的 250mL 棕色塑料瓶中，天平上去皮，加入 146 mL 自备的去离子水，充分摇晃直到溶解（约需
10-20 分钟）。此溶液简称为 30% AB 溶液，最好在一个月内用完，4℃保存。
C：配 SSCP PAGE 胶：在一个 250mL 的三角瓶中，先按下表的用量加入去离子水、30% AB 溶液和 10×TBE 电泳液。丙烯酰胺单体溶液具有神经毒性，一定要戴手套操作。
C：摇晃混匀。最好能抽真空 10-15 分钟以去除溶液中的氧气（氧气能抑制丙烯酰胺聚合反应），无条件也可以不脱氧。
D：加入 500uL 10%APS 和 100uL TEMED，迅速摇匀后倒胶。
E: 在 PAGE 胶的液面距离达到顶部时停止灌胶，插入梳子。
F: 室温聚合 30-60 分钟（低温抑制聚合反应，故最好室温）。
G: 待 PAGE 胶凝固后拔出梳子，用 1×TEB 液冲洗加样孔。
H: 放 4℃冰箱预冷 30 分钟-12 小时。为了防止 PAGE 胶收缩，最好在其顶部加少量 1×TBE 缓冲液。使用预冷的 PAGE 胶有利于单链 DNA在电泳时保持其构型，这些构型靠 DNA 序列间的微弱的链内互补形成，对温度很敏感。温度越高，这些微弱相互作用越不稳定。
4. 将预冷后的 PAGE 凝胶板固定在电泳装置上，往上槽和下槽中加入足够 1×TEB 电泳液。
5. 取 3-5 uL SSCP-PCR 样品，加入等体积 2×DNA 非变性 PAGE 上样液，85℃处理 5 分钟后冰浴。用前短暂离心后取 2 uL 上样。上样量跟检测方法的灵敏度相关，上述上样量是针对核酸银染检测法。
6. 连接电源线，打开电源开关。如果 PAGE 中不含甘油，则使用 25W 的功率，电泳 5-7 小时（对 3-40cm 长的 PAGE 胶而言）。如果使用含甘油的pAGE，则使用 8W 的功率，电泳 16-18 小时。由于温度变化过大会改变 DNA 构型，所以电泳时最好能保持恒温。对不含甘油的 PAGE，最好恒温在 4℃、对含甘油的 PAGE，最好恒温在 25℃。
1. 终止电泳，取出凝胶进行后续的银染处理。不建议使用灵敏度低于银染的方法，因为 SSCP 异构体的数量都比较少，一般方法没法检测到。
