大提无内毒素质粒 DNAOUT -上海雅吉生物科技有限公司

规格	价格	库存
50次	￥ 980	200

CAT#:81107-50

常温运输和保存 (部分低温)

大提无内毒素质粒 DNAOUT Endo-free Max Column Plasmid DNAout

使用手册 V1.5

产品及特点	本试剂盒采用改进 SDS-碱裂解法裂解细胞，通过独特的内毒素清除剂选择性结合离心除去内毒素，然后离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低 pH 值状态下选择性地结合溶液中的质粒 DNA ，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。操作简单，只在经典的柱式质粒 DNA 提取前，增加菌体内毒素清除一步。 1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。 2. 独特工艺配方清除内毒素，内毒素含量极低 (<0. 1 EU/μg DNA) ，细胞转染效果极佳。也可直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序、等各种分子生物学实验。
规格及成分	试剂盒组成、储存、稳定性：
		成份	保存	编号	大纸盒包装
		平衡液	室温	90901	5ml
		RNase A (10mg/ml)	-20℃	60205a	150µl
		溶液 P1	4℃	60205b	15 ml
		溶液 P2	室温	60205c	15 ml
		溶液 N3	室温	3160	15 ml
		去蛋白液 PE	室温	90303	16 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇
		内毒素清除剂	-20℃	60408	5 ml
		漂洗液 WB	室温	1 1 1205	13 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇
		洗脱缓冲液 EB	室温	1 1 1206	15 ml
		吸附柱 AC	室温	1 1 1207	50 个
		收集管 (2ml)	室温	1 1 1208	50 个
		使用手册		81107sc	1 份
运输及保存	本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。内毒素清除剂常温运输， 4 度可以保存一个月，长期保存放-20℃。储存事项： 1. RNaseA 保存在即用型甘油缓冲液中，常温运输，收到后，不超过 25℃室温至少保存 6 个月， 4 ℃保存 12 个月，长期保存放－20℃。 2. 第一次使用时，将试剂盒所带的全部 RNase A 加入溶液 P1 后 (终浓度 100ug/ml) 置于 2-8 ℃保存。如果溶液 P1 中 RNase A 失活，提取的质粒可能会有微量 RNA 残留，在溶液 P1 中补加 RNase A 即可。

	3. 环境温度低时溶液 P2 中 SDS 可能会析出浑浊或者沉淀，可在 37℃水浴加热几
	分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。
	4. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH 值变化，各溶液使用后应及
	时盖紧盖子。
使用方法	操作步骤： (实验前请先阅读注意事项) 提示：第一次使用前请先在漂洗液 WB 瓶中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入! 将 RNase A 全部加入溶液 P1 中，混匀，每次使用后置于 2-8 ℃保存。 1. 取 1.5-4.5 ml 过夜培养的菌液， 12,000 rpm 离心 30 秒，尽可能的倒干上清，收集菌体。收集超过 1.5 ml 菌液，可以离心弃上清后，在同一个 1.5ml 管内加入更多的菌液，重复步骤 1 ，直到收集到足够的菌体。 2. 用 250μl 溶液 P1 重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。 3. 加 250μl 的溶液 P2 ，温和地上下翻转 6 -8 次使菌体充分裂解，室温放置 4 分钟。温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组 DNA 剪切断裂！所用时间不应超过 5 分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要准确的 5 分钟。 4. 加 250μl 溶液 N3 ，立即温和地上下翻转 6 -8 次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀。 12,000 rpm 离心 10 分钟，小心取上清至新管，避免吸取到漂浮白色沉淀。加入溶液 N3 后应该立即混匀，以免产生 SDS 的局部沉淀。 5. 加入 0. 1 体积(上清的体积的 10%，约 80µl)的内毒素清除剂到上一步所得上清，颠倒旋转混匀，冰浴或者插入碎冰中(或冰箱冷冻室)放置 5 分钟直到浑浊变清亮透明 (或仍旧稍有浑浊) ，中间偶尔混匀几次。内毒素清除剂加入上清后，上清会变得浑浊，但是冰浴后应恢复清亮(或稍浑浊) 。 6. 常温放置 3-5 分钟，温度恢复室温溶液很快变为浑浊，颠倒混匀。如室内温度较低或者想加快速度可以在 37-42℃水浴，将很快变浑浊，颠倒混匀。 7. 室温 12,000 rpm 离心 10 分钟分相。上层水相含 DNA ，下层蓝色油状相含内毒素和其它杂质。将含 DNA 的上层水相转移到新管 (注意不要吸到蓝色油状层，里面含内毒素等杂质) ，弃油状层。平衡液预处理吸附柱：使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤，具体方法参见前文“关于平衡液的使用” 8. 向上层水相中加入 0.5 体积异丙醇 (约 370µl) 后充分颠倒混匀后分两次 (每次不超过 700µl) 转入吸附柱 AC 中 (吸附柱放入收集管中) ， 12,000 rpm 离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液。直到所有混合溶液通过此吸附柱。 9. 加入 500μl 去蛋白液 PE ， 12,000 rpm 离心 30 秒，弃废液。此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质，如所用菌株为 JM 系列、 HB101 等 endA 菌株或野生型菌株，核酸酶含量丰富，应加此步骤；如所用菌株为 XL- 1 Blue、 Top10 和 DH5α等缺陷型菌株，核酸酶含量低，则可略过此步骤。 10. 加入 600μl 漂洗液 WB (请先检查是否已加入无水乙醇!) ， 12,000 rpm 离心 30 秒，弃掉废液。再加入 600μl 漂洗液 WB ，重复漂洗一次。

1 1. 将吸附柱 AC 放回空收集管中，12,000 rpm 离心 2 分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

12. 取出吸附柱 AC ，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加 50- 100μl 洗脱缓冲液 EB (洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中加热效果更好) ，室温放置

2 分钟， 12,000 rpm 离心 1 分钟。如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置 2 分钟，离心 1 分钟。

洗脱体积越大，洗脱效率越高。如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于 30μl ，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。

注意事项

1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到 13,000rpm 的传统台式离心机，如 Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

2. 提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒，建议接种单菌落于 1.5-4.5 ml 加合适抗生素的 LB 培养基，过夜培养 14- 16 个小时，可提取出多达 20µg-50µg 的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于 10kb 的大质粒，应适当加大菌体使用量，使用 5- 10 ml 过夜培养物，同时按比例增加 P1、P2、N3 的用量，其它步骤相同。

3. 得到的质粒 DNA 可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。 OD260 值为 1 相当于大约 50μg/ml DNA 。电泳可能为单一条带，也可能为 2 条或者多条 DNA 条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过 90%。

4. 质粒 DNA 确切分子大小，必须酶切线性化后，对比 DNA 分子量 Marker 才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。

5. 洗脱液 EB 不含有螯合剂 EDTA ，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保 pH 大于 7.5 ，pH 过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在－ 20℃ 。质粒 DNA 如果需要长期保存，可以用 TE 缓冲液洗脱 ( 10mM Tris-HCl ， 1mM EDTA ，pH 8.0) ，但是 EDTA 可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

关于平衡液的使用

介绍：核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团，提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液，若不小心碰到，请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖，以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成，请加热至 37℃使沉淀完全消失。