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T4 RNA Ligase 2, truncated
产品名称:
T4 RNA Ligase 2, truncated
英文名称:
T4 RNA Ligase 2, truncated
型号:
R06357
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 T4 RNA Ligase 2, truncated (T4 Rnl2, truncated或Rnl2 (1-249)),即T4 RNA连接酶2截短型,该酶仅包含T4 RNA连接酶2 N端249个氨基酸,可特异性地将5’端预腺苷酰化的DNA或RNA (App-DNA或App-RNA)连接到RNA的3’羟基。

T4 RNA Ligase 2, truncated与T4 RNA Ligase 2的酶活性完全不同,后者是一种ATP依赖的dsRNA ligase,而前者是一种不依赖于ATP的,依赖于5’端预腺苷酰化的单链核酸连接酶。

T4 RNA Ligase 2, truncated常用于microRNA (miRNA)等3’端为羟基的单链RNA在克隆、高通量测序建库或PCR检测等时,在3’羟基端添加5’端预腺苷酰化的DNA或RNA接头。

T4 RNA Ligase 2, truncated只能利用5’端预腺苷酰化的单链DNA或RNA作为3’端接头,因此可以大大降低连接反应的背景,通常是小RNA等建库时的优先选择。

T4 RNA Ligase 2, truncated连接时不需要ATP,但需要5’端预腺苷酰化(也称预腺苷化、腺苷酰化或腺苷化)底物。即使在有ATP存在的情况下,T4 RNA Ligase 2, truncated也不能催化连接单链DNA或RNA 5'-P末端与3'-OH末端之间形成磷酸二酯键。而T4 RNA Ligase 1可以在ATP存在的情况下,催化连接单链DNA或RNA 5'-P末端与3'-OH末端之间形成磷酸二酯键。因此T4 RNA Ligase 2, truncated特别适用于small RNA library的制备,不管是进行miRNA的测序还是进行directional mRNA-Seq,该酶都可以提高建库的质量,并有效降低连接反应的背景。

T4 RNA Ligase 2, truncated催化连接AppDNA和ssRNA的效果请参见图1。

图1. T4 RNA Ligase 2, truncated和N公司的同类产品(Competitor T4 RNA Ligase 2, truncated)催化连接AppDNA和ssRNA的效果图。使用本产品或国外N公司的T4 RNA Ligase 2, truncated,即T4 Rnl2(1-249),在20µl反应体系中加入图中指定量的本产品或国外N公司的T4 Rnl2, truncated,25℃孵育60 min进行连接反应,反应完毕后立即取样在65℃孵育20 min终止反应,加入变性上样缓冲液,在95℃孵育5 min后放至冰浴中,随后用15%尿素(7M)变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析,最终进行核酸染色和荧光成像分析。如图所示,本产品与N公司的产品相比,具有类似的催化效果。

用途:5’末端预腺苷酰化的单链DNA或者RNA与单链RNA的3’羟基末端连接;cDNA文库构建中连接5’末端预腺苷酰化单链寡核苷酸和小RNA;链特异性的cDNA文库(strand-specific cDNA library)构建中连接5’末端预腺苷酰化单链寡核苷酸和RNA;二代测序中,miRNA文库构建中RNA的3’末端与接头之间的连接;cDNA文库的构建以进行小RNA转录组分析(small-RNA transcriptome analysis)。

来源:大肠杆菌表达的重组蛋白,表达基因为T4嗜菌体T4 RNA ligase 2 N端1-249位的氨基酸。

活性单位定义:200 units is defined as the amount of enzyme required to give 80% ligation of a 31-mer RNA to the pre-adenylated end of a 17-mer DNA (Universal miRNA Cloning Linker, Beyotime, Cat. No. R0702) in a total reaction volume of 10 µl in 1 hour at 25℃.

纯度:无DNA内切酶和外切酶活性,无RNA酶活性,无蛋白酶活性。

酶储存溶液:10 mM Tris-HCl (pH7.5), 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM DTT, 50% (v/v) Glycerol.

失活或抑制:65℃加热20 min可使T4 RNA Ligase 2, truncated失活,或加入蛋白酶K或EDTA也可以抑制其活性。

包装清单:

产品编号 产品名称 包装
R0635S-1 T4 RNA Ligase 2, truncated (200U/µl) 25µl
R0635S-2 10X T4 Rnl2, truncated Buffer 75µl
R0635S-3 PEG8000 (50%, RNase free) 400µl
说明书 1份

 

产品编号 产品名称 包装
R0635M-1 T4 RNA Ligase 2, truncated (200U/µl) 100µl
R0635M-2 10X T4 Rnl2, truncated Buffer 300µl
R0635M-3 PEG8000 (50%, RNase free) 1.5ml
说明书 1份

 

产品编号 产品名称 包装
R0635L-1 T4 RNA Ligase 2, truncated (200U/µl) 500µl
R0635L-2 10X T4 Rnl2, truncated Buffer 1.5ml
R0635L-3 PEG8000 (50%, RNase free) 7.5ml
说明书 1份

保存条件:

-20℃保存,至少一年有效。

注意事项:

本产品提供的试剂均用不含DNA酶和RNA酶的水配制,可直接用于3’端为羟基的单链RNA和5’端腺苷酰化的DNA或RNA之间的连接反应。

可根据具体应用选择合适的操作方法,可能需准备额外的试剂,R0102 RNase inhibitor、R0022 DEPC水等。

使用本产品连接ssRNA和AppDNA时,建议使用的PEG8000的浓度为10%-30%,适当提高PEG8000的浓度,会显著提高T4 Rnl2, truncated的催化的连接效率,而不改变其反应特性。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.用于连接5’端腺苷酰化并且3’端不是羟基的(例如为氨基)单链DNA (AppDNA-NH2)和3’端为羟基的单链RNA (ssRNA)的使用说明具体如下。需要提前准备好待连接的样品,以及Universal miRNA Cloning Linker (R0702, Beyotime)或自备的适当接头。
2.参考下表在冰浴中配制如下反应体系:

Reagent Volume Final Concentration
ssRNA xµl 0.5 or 1µM
DEPC-treated Water (4-x-y)µl -
Universal miRNA Cloning Linker (R0702, Beyotime) yµl 1 or 0.5, or 2 or 1µM
PEG8000 (50%, RNase Free) 12µl 0.3
10X T4 Rnl2, truncated Buffer 2µl 1 X
RNase Inhibitor (40U/μl) 1µl 2U/μl
T4 RNA Ligase2, truncated (200U/µl) 1µl 10U/µl
Total Volume 20µl -

注意:
a.由于涉及RNA操作,需要严格按照RNA操作的规范进行,避免RNase污染,相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。推荐在连接体系中添加RNase Inhibitor,以避免ssRNA或其连接产物的降解,尽管经测试我们发现在严格操作的情况下,不加RNase Inhibitor也不会导致ssRNA或其连接产物发生明显降解。
b.进行连接反应时,如果样品RNA比较珍贵,希望充分被连接,可以按照接头和样品RNA的摩尔比为2:1的比例进行连接;如果样品RNA比较充裕,同时感觉接头的成本偏高时,可以按照接头和样品RNA的摩尔比摩尔比1:1甚至1:2的比例进行连接反应,这样可以很好地节省接头。ssRNA的用量可以根据实际的样品量进行适当调节,相应的接头的用量也按照比例进行适当调整即可。
c.如果同时进行多个连接反应,可以把上表中除ssRNA之外的所有溶液和酶提前预混合,然后再分装到各反应管内。
3.连接反应:25℃, 孵育60min。为了使连接反应更加充分,可以适当延长连接反应时间。
4. 终止反应:65℃,孵育20min。

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