2.一般纯化最好选用用黄化苗。如果用绿色组织（如叶片），需将植物提前放在暗室至少 3 天以降低淀粉含量，否则淀粉颗粒将干扰线粒体的纯化。
3.一次实验需要 40 mL 匀浆液、约 90 mL 洗涤液和 35 mL 密度梯度离心介质（配制方式是一次性将 9.8g (8.7mL) Percoll 加入到 26.3mL 离心介质溶液中，充分混匀后得到 35mL 密度梯度离心介质）。这三种溶液用前均需要加入 BSA 干粉使其终浓度为 0.1%（100mL 溶液加 0.1g BSA 干粉，轻柔颠倒混匀或搅拌溶解后放冰上预冷待用）。每次实验用多少配多少，不要预先将所有 BSA 干粉加入， 否则容易长菌。
二：线粒体粗提操作流程
1.将 10 g 的绿色植物组织（如去叶脉后的嫩叶子，愈伤组织）或 20 g 干净的非绿色植物组织（如发芽组织、根、块茎等）浸泡在冰水中 10 分钟，用纸吸干液体后浸泡在预冷的 40 mL 匀浆液（需先加 0.1% BSA）中，在浸泡状态下剪成 1cm2大小的碎片。注意：如果样品可分成多组平行处理，得到线粒体粗提物后再汇集， 否则线粒体产率将急剧降低。
2.将匀浆液和其中的植物组织碎片转移到 Waring 匀浆器中，中速匀浆 3 次，每次
15 秒，每次之间间隔 10 秒以便让碎片沉淀下来到刀片处。也可使用研磨法。具
体操作是将匀浆液和其中的植物组织碎片转移到预冷的研钵中，研磨 3-4 分钟。注意：植物组织匀浆后释放的物质会使匀浆液酸化，降低 pH，而线粒体对 pH 变化非常敏感，因此建议匀浆后用 pH 试纸检测匀浆液的 pH，如果低于 7.0，必须用自备的 5 M KOH 将 pH 调到 7.0 以上才进入下一步。
3.用带柄尼龙筛过滤匀浆液，穿透液可通过预冷的漏斗收集到预冷的 50 mL 的塑料离心管中。带柄尼龙筛可以洗干净后可以反复使用。
4.在低速固定角度冷冻离心机上 4℃ 1000 g 离心 5 分钟，沉淀为未破碎的细胞、破碎细胞的碎片、细胞核和淀粉颗粒，上清含线粒体。小心转移上清到新的预冷的 50mL 塑料离心管中。
5.将装上清的离心管在水平冷冻离心机上 4℃ 12,000 g 离心 20 分钟，弃上清液， 所得棕绿色沉淀即为纯化的线粒体粗提物。有时沉淀底部还有白色的淀粉沉淀， 属于正常现象。
6.加入 10 mL 预冷的洗涤液（需先加 0.1% BSA，下同）中，用软毛笔轻柔重悬线粒体沉淀(如果最底下有白色淀粉沉淀，需要避免重悬之)。不能剧烈震荡，否则线粒体容易破裂。
7.将线粒体重悬液转移到新的 50mL 离心管中，再加入 30mL 预冷的洗涤液（终体积为 40 mL）中，4℃ 1000 g 离心 5 分钟。线粒体将在上清中。
8.将上清转移到新的预冷的 50mL 离心管中，4℃ 12000 g 离心 20 分钟，沉淀为线粒体。小心弃上清。到此步时，线粒体回收率一般在 15-30%。
9.在沉淀中加入 2 mL 预冷的洗涤液。用软毛笔轻柔重悬，得到线粒体粗提液。如果有平行提取，可将最多 4 管线粒体沉淀重悬在 2 mL 洗涤液中。线粒体粗提液中线粒体的回收率一般在 45-75%。
10.所得线粒体粗提液含其他细胞器（如类囊体膜, 质体, 过氧化物酶体， 乙醛酸循环体,或细菌）污染，但可直接用于 PCR 级线粒体 DNA 和 RNA 的提取、呼吸链功能测定、蛋白浓度测定和线粒体精提。如果需要长期保存，则可以在线粒体重悬液中加入 1/20 体积的自备 DMSO，混匀后分成 0.5 mL/管，然后放-80℃保存。如此保存的线粒体酶活性和膜完整性在几年内都不会发生变化。
三：细胞核 DNA 的去除（纯化测序级的线粒体 DNA 才需要进行此操作。本产品不
提供相关试剂，实验步骤仅供参考）
11.预留 50uL 线粒体粗提液做对照，在约 2 mL 剩余的线粒体粗提液中加入 40 uL 25mM 的 MgCl2，再加入 200ug DNase 干粉或溶液（总量为 200ug 即可），混匀后冰上放置 60 分钟降解 DNA。取少量样品（如 50uL）在 PCR 仪器中加热到 95℃变性 10 分钟灭活 DNase，再取其中的 10uL 和 10uL 预留的样品一起进行细胞核基因专一性 PCR，如果 DNase 处理的样品没有扩增，而预留样品有扩增，则表明 DNA 去除比较干净（达到 PCR 检测的极限），则进入下一步。如果未去除干净，则继续在冰上放置，直到 PCR 检测不到细胞核 DNA。
12.加入 0.32 mL 预冷的自备 0.5M 的 EDTA 溶液和 40mL 预冷的洗涤液。
13.4℃ 1000 g 离心 5 分钟，将上清转移到新的预冷的 50mL 离心管中，4℃ 12000g 离心 20 分钟，沉淀为去除细胞核 DNA 的线粒体。重悬在 2mL 洗涤液中。四：线粒体精提操作方案（需要 40000g 的超速冷冻离心机）
14.在 50 mL 预冷的塑料离心管中先后加入 35 mL 预冷的密度梯度离心介质（配制方法见第三步，用前需先加 0.1% BSA）。
15.将 2 mL 线粒体粗提物重悬液铺在密度梯度离心介质上。
16.在超速水平离心机上 4℃ 40,000 g 离心 45 分钟，最上层为黄色或橙色的质体带（如果材料是绿色植物，此带将是绿色），其下的白色不透明的带即为线粒体，管底沉淀为过氧化物酶体。其示意图如下：
17.用广口吸管（可将 1 mL 蓝抢头中间剪断后使用）收集线粒体带，注意避开其上的质体带过氧化物酶体沉淀，估计所取含线粒体溶液的体积。
18.在 15-20 分钟的时间内缓慢加入至少 4 倍体积的预冷的洗涤液。
19.转入 50 mL 塑料管离心管中，在冷冻离心机上 4℃ 15,000 g 离心 20 分钟，沉淀为线粒体。
20.将线粒体沉淀用软毛笔小心重悬在至少 4 倍体积的预冷的洗涤液中，在冷冻离心机上 4℃ 15,000 g 离心 20 分钟，弃上清，沉淀即为洗涤后的线粒体精提物。到此步时，线粒体回收率一般在 5-15%。
21.将精提的线粒体重悬在 1mL 预冷的洗涤液中。重悬的线粒体可以立即使用，在冰上最多可放置 5-6 小时。如果需要长期保存，则可以在线粒体重悬液中加入1/20 体积的 DMSO，混匀后分成 0.5 mL/管，然后放-80℃保存。如此保存的线粒体酶活性和膜完整性在几年内都不会发生变化。
五：线粒体后续处理（本产品不提供相关试剂，实验步骤仅供参考）
22.DNA 提取：离心得线粒体沉淀，再按常规的 SDS-蛋白酶 K 酶解，酚氯仿抽提， 乙醇-盐沉淀的方法制备线粒体 DNA。也可以用细菌 DNA 提取的试剂盒制备DNA。
23.RNA 提取：离心得线粒体沉淀，再按常规的 Trizol 方法制备线粒体 RNA。
24.总蛋白提取：按细菌总蛋白提取方法。
25.线粒体内膜，外膜、基质纯化：请自备方法。
26.其他功能检测：请自备方法。
